| Project/Area Number |
22K08155
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53020:Cardiology-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
木岡 秀隆 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70642099)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 翻訳後修飾 / ストレス応答 / プロテオミクス |
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| Outline of Research at the Start |
翻訳後修飾NEDD化は、可逆的タンパク質翻訳後修飾の一つであり、E3リガーゼの活性化、およびその他の標的タンパク質の局在化等を介して細胞恒常性維持に関与している。脱NEDD化酵素COP9 複合体(CSN)の心臓特異的欠損マウスは心不全を呈し、ヒト不全心筋においてもNEDD化タンパク質の増加が報告されているが、標的基質の同定を含む分子機序は不明である。
本研究では培養心筋細胞およびマウス生体においてストレス負荷刺激を行う事により、プロテオミクス解析、独自の機能解析系を駆使しストレス時にNEDD化修飾を受ける心臓特異的基質を同定し、心筋細胞のストレス耐性機構解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2022年度は、NEDD化修飾の有無により特異的に変化するタンパク質―タンパク質間相互作用を探索した。
薬理学的NEDD化阻害(MLN4924)および促進(CSN5阻害薬)薬を用いた予備実験を行ったうえで、質量分析法によるタンパク質インタラクトーム解析、更には細胞および組織を用いてNEDD化修飾の有無により変化するタンパク質―タンパク質間相互作用の探索を行った。HSP70ファミリーの分子シャペロンHSC70が、NEDD化修飾を受けたCullin-Rbx型E3ユビキチンリガーゼ(CRL)とNEDD化依存的に特異的に結合することを発見した。CRLはNEDD化修飾によりユビキチンリガーゼ活性が増強することが知られているが、HSC70とCRL間のタンパク質間相互作用は今まで知られていない新規相互作用である。変異体を用いた検討によりHSC70のN末に存在するヌクレオチド結合ドメイン(NBD)がCRLとの相互作用に必要なドメインであることが明らかになった。NBDはADP/ATPの交換に関与し、NBDに結合することが既知である蛋白質群（ヌクレオチド交換因子）はHSC70の三次元構造をアロステリックに変化させ、分子シャペロン複合体の機能制御に関与することが知られており、両者の機能的相互作用についても検討した。まず、CRLがHSC70のATPase活性に与える影響を調べたところ、NEDD化CRLはHSC70のATPase活性を増強させることが明らかになり、また一方で、HSC70はNEDD化CRLのユビキチンリガーゼ活性を増強させることを明らかにした。両者の相互作用は、分子シャペロンとユビキチンリガーゼの機能をストレス負荷に応じて制御するストレス応答機構であると考えられ、今後更に検討を進めて行く。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生化学的検討に加えて、細胞機能評価を並行して行っている。現在のところ生化学的基盤を盤石にすることが、今後の研究進捗に重要であると考えていることから、細胞機能評価実験に関しては当初の予定よりやや遅れているものの、一方で生化学的知見の蓄積は期待以上に進める事が出来ていると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ストレス刺激によりNEDD化CRLが増加することから、NEDD化CRLとHSC70の結合はストレス応答機構であると考えられる。今後は、生化学的解析としてCRLs側の結合ドメインの検索、および心臓特異的分解基質の同定、機能解析に関しては今回明らかにした新規ストレス応答性タンパク質相互作用の細胞機能的意義をHSC70ノックダウンや、変異体を用いたレスキュー実験により検討する。CRLの既知の活性制御機構として、COP9シグナロソーム（CSN）による脱NEDD化修飾が知られている。HSC70がCRL-CSN経路に与える影響も検討する予定である。
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