シングルセル解析を用いた運動誘発性気道リモデリングの包括的検討

• Project/Area Number: 22K08278
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 小屋 俊之 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90444158)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 青木 亜美 新潟大学, 医歯学系, 助教 (60827674)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 運動誘発性気道収縮 / 気道リモデリング / シングルセル解析

Outline of Research at the Start

アスリートに喘息罹患率が高いことは以前より知られているが、詳細な病態のメカニズムは不明な点が多い。我々は、マウスに強制運動を反復負荷することによって気道抵抗上昇および気道リモデリングが炎症細胞非依存性に生じることを報告している。この運動誘発性気道収縮モデルの気道リモデリングのメカニズムを明らかにする目的にモデルマウスより気道および肺由来の細胞を単離し、１細胞レベルでの網羅的遺伝子発現解析を行い、運動負荷に伴う気道ストレスが及ぼす細胞レベルの影響を解析し、病態を詳細化する。

Outline of Annual Research Achievements

運動誘発性気道収縮のマウスモデルを使用して、気道リモデリングのメカニズムをscRNA-seqを使って、１細胞レベルでの網羅的遺伝子発現解析を行い、運動負荷に伴う気道ストレスが及ぼす細胞レベルの影響を解析し、病態を詳細化することを目的としている。
マウスを使用した運動誘発性気道収縮モデルはすでに確立しており（Ueno H, Koya T.et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2020;63:57-66)、このモデルを元に、運動負荷期間の改変モデルを作成する（現在プロトコール検討中）。運動負荷後に採取した肺はPBSで十分に還流したのち、気道および肺全体の細胞を酵素で処理し、FACSAriaTMを用いて死細胞除去かつシングルセル単離を行う。
これまでの実験結果から、上皮細胞から産生されるシスティニルロイコトリエンが気道収縮・気道リモデリングに関与していることを示されている。その中でEGFリガンドである、amphiregulinの気管支肺胞洗浄液中で運動期間に比例して上昇することも示されている。システィニルロイコトリエンとamphiregulinの関連性について、amphiregulinノックアウトマウスを使って解析する。
また、scRNA-seq (10xGenomics, Chromium) については細胞単離後のライブラリー作成からシークエンス、解析パイプラインCell Rangerでのデータ処理までは外部機関に委託する予定である。コストの問題から厳選した検体を使用するため、予備実験を綿密に行う必要があり、それに時間を要する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

実働部隊である大学院生の臨床業務との分業が円滑に進まず、実験量が極端に低下したことと、実験の再現性を確認する時間が予想以上に必要としたため、進捗は遅れている。

Strategy for Future Research Activity

3月より担当大学院生が増員されたため、実験は進んでいる。現在遺伝子改変マウス（予備実験で使用するamphiregulinノックアウトマウス）を使った実験を行っており、結果も出始めている。