| Project/Area Number |
22K08332
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53040:Nephrology-related
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
谷川 俊祐 熊本大学, 発生医学研究所, 講師 (10726318)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | ネフリン / iPS / 病態再現 / 腎臓オルガノイド / 糸球体 / 多発性嚢胞腎 / 腎臓 |
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| Outline of Research at the Start |
腎臓のネフロン（糸球体と尿細管）は生体の恒常性の維持に必須である。ネフリンは糸球体のろ過膜を構成し、その変異はネフローゼの原因となる。一方、ポリシスチンは、細胞の繊毛の膜状に発現しその発現低下は尿細管や尿管に多数の嚢胞形成を誘発し多発性嚢胞腎（PKD）を呈して腎不全となる。本計画では、腎臓の構造と病態を再現できる腎臓オルガノイドを基盤とし、ミスセンス変異を持つネフリンやポリシスチンの膜移行障害を小胞体ストレス応答因子の人為的制御により矯正する技術開発を行い、腎疾患の治療法を開発することを目的とする。本計画の知見は、先天性腎疾患の治療に留まらず、蛋白尿の低減や腎嚢胞軽減にも貢献すると期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
腎臓は主要機能単位であるネフロン（糸球体と尿細管）によって生体の恒常性を維持している。ネフリンは糸球体のろ過膜を構成する膜タンパク質で、その変異はネフローゼの原因となる。一方、ポリシスチンは、細胞の繊毛に発現する膜タンパク質でその発現低下は尿細管や尿管に多数の嚢胞形成を誘発し多発性嚢胞腎（PKD）を呈して腎不全となる。申請者は、先天性ネフローゼ患者由来のiPS細胞から糸球体を誘導することによって、濾過膜の形成異常を再現し、ネフリンの膜移行障害が疾患の病態であることを証明した（Tanigawa et al. Stem Cell Reports, 2018）。さらに、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)患者由来のiPS細胞から腎臓オルガノイドを誘導し嚢胞の再現にも成功している（Kuraoka et al. J Am Soc Nephrol, 2020）。本計画では、腎臓の構造と病態を再現できる腎臓オルガノイドの実験系を基盤にして、疾患原因分子であるミスセンス変異を持つネフリンやポリシスチンの膜移行障害を小胞体ストレス応答因子の人為的制御によって矯正する技術開発を行い、腎疾患の治療法を開発することを目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本計画にて立案した変異タンパク質の膜移行を効率的にモニターできるiPS細胞の樹立に取り組み、腎臓の主要機能である血液ろ過に重要な糸球体のネフリンタンパク質の膜移行を化学発光によって検知(HiBiT NanoLucルシフェラーゼシステム)できる患者由来iPS細胞の樹立に着手した。計画通り目的のiPS細胞を樹立し、この細胞から作成した腎臓オルガノイドにおいてネフリンと共にHiBITの発現を確認することができた。しかし、ネフリンの膜移行をルシフェラーゼアッセイによって検知できないことが判明した。細胞膜外のネフリンを検知するために11アミノ酸からなるHiBiTのペプチドタグはＮ末端に挿入しているが、そのことが膜移行には影響しないことをHEK293細胞において確認できていた。しかし、ネフリンの遺伝子変異を修復した患者由来iPSにおいても同様にルシフェラーゼを検知できなかった。そのため、HiBItシステムの代替として腎臓オルガノイド由来の糸球体を薬剤スクリーニングに適用できる培養系の開発に取り組んだ。これまでにiPS細胞から糸球体のポドサイトを高効率に誘導する方法を報告しており（Yoshimura et al., JASN 2019）、この方法を応用して384 well plate上で糸球体を多く含むオルガノイドを二次元で培養しネフリンの膜局在を観察できる方法を開発した。
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| Strategy for Future Research Activity |
糸球体を多く含むオルガノイドを二次元で培養する方法を開発しつつある。これに並行して患者由来ネフリンの膜移行を促進する薬剤の検索と培養条件の検討により温度条件が患者由来腎臓オルガノイドの糸球体における変異ネフリンタンパク質の膜局在化を促進することを発見した。
これらを基に最適の温度条件でオルガノイドを二次元培養することで薬剤のハイスループットスクリーニングが可能になりつつある。さらに、変異ネフリンタンパク質の温度によるフォールディング調整が膜移行の促進に関与することが示唆されたことから、今後ケミカルシャペロン系の薬剤を中心にスクリーニングすることで効果的にネフリンの膜局在を促進する薬剤を同定できることが期待できる。また、これらの知見を変異ポリシスチンタンパク質の膜移行矯正に応用することで腎嚢胞抑制にも効果が期待できる。
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