フィブロネクチン(FN)腎症患者に認めた変異FNの糸球体内沈着機序と治療法の開発

• Project/Area Number: 22K08335
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53040:Nephrology-related
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 竹田 徹朗 獨協医科大学, 医学部, 教授 (10361924)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 阿部 利弘 獨協医科大学, 医学部, 助教 (90833377)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: フィブロネクチン / 遺伝性腎疾患 / 糸球体沈着

Outline of Research at the Start

フィブロネクチン(FN)腎症は糸球体内へのFNの沈着を特徴とする常染色体顕性遺伝性疾患である。10数年の経過で末期腎不全に至る。FN腎症患者の血中FN濃度は正常で、かつ糸球体以外の臓器にFNの沈着はないため、変異FNは細胞生物学的機能異常はないが、糸球体に徐々に蓄積することが想定される。本研究の目的は、変異FNがいかにして糸球体内に沈着するのかを明らかにすることである。①in vitro実験において血漿型FNに特徴的な2量体形成のアセンブリーが阻害されるか、②in vivoの実験においてタグ付き変異FNをラットに投与し、糸球体内に沈着するかどうか変異FNの病原性を証明する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では変異フィブロネクチン(FN)がいかにして糸球体内に沈着するのかを明らかにすることである。
①私たちが診断したFN腎症3例のうち若年発症例の変異転写産物シークエンスを確認する。
患者末梢血白血球からmRNAを抽出し、PCRおよび直接シークエンス法を用いてFN1転写産物のシークエンス解析を行うことを画策したが、コロナ禍のため患者受診差し控えやコロナ感染症罹患などにより、ｍRNA抽出が遅れ、PCRでFN1転写産物を検出を試みたが、現時点で発現が確認できていない。
②FN1全長cDNAを業者から購入し、鋳型とするため、まずはそのシーケンスが正しいかどうかを確認した。
日本腎臓学会など関連学会でのフィブロネクチン腎症や糸球体へのフィブロネクチン沈着に関する情報交換を対面あるいはオンラインで行った。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

コロナ禍のため患者受診差し控えや患者自身のコロナ感染症罹患などにより、受診が遅れ、RNA抽出するタイミングが遅れてしまった。また、分子生物学的試薬やキットなども輸入遅延の影響があり、入荷を待つことが多かった。

Strategy for Future Research Activity

①白血球にFN1遺伝子発現を認めない場合は尿沈渣（尿中落下細胞）を用いてｍRNA抽出を行う。転写産物のシークエンスより予想される変異FNのC末端領域を同定する。
②FN1全長cDNAを鋳型にして晩期発症変異（A）と①で同定した若年発症変異（B）cDNAを作成し、その変異タンパクを発現させる。FN1全長cDNAを鋳型にしてPCRを用いたmutagenesisを行い、A,Bの2種の変異cDNAをFLAGタグ付き発現ベクターに組み込む。次に、A,B両者の発現ベクターをHEK293細胞に遺伝子導入する予定である。