腹膜透析による腹膜線維化と石灰化の病態解明～リンの関与とマグネシウムの競合作用

Research Project

Project/Area Number	22K08355
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 53040:Nephrology-related
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	山田俊輔九州大学, 大学病院, 助教 (10419608)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中野敏昭九州大学, 医学研究院, 准教授 (10432931) 鳥巣久美子九州大学, 医学研究院, 准教授 (20448434)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	腹膜透析療法 / 腹膜石灰化 / りん / マグネシウム / CPP / 被嚢性腹膜硬化症 / 腹膜透析 / リン
Outline of Research at the Start	本研究は腹膜透析患者の重大な合併症である腹膜線維化および被嚢性腹膜硬化症(EPS)の予防と進展を抑制する有効な治療としてマグネシウム(Mg)に注目した基礎実験である。Mgは腹膜透析患者の体内で増加するcalciprotein particle (CPP)の形成を抑制し、CPPによる腹膜の炎症や線維化を阻止できることを明らかにする基礎研究である。本研究の遂行により、腹膜線維化やEPSの予防や進展抑制のみならず、種々の臓器における炎症や線維化過程をも抑制できる治療法として、Mg補充療法を定期することを最終目標に設定している。
Outline of Annual Research Achievements	本研究の主目的は、被嚢性腹膜硬化症(EPS)の重要な表現型である腹膜石灰化にリン負荷およびリン負荷に伴うCPP (calciprotein particle)の形成が関与することを実証し、その機序を解明することである。さらに、リン負荷およびCPPによって促進される腹膜石灰化が、マグネシウムの経口投与あるいは経腹膜投与によって改善するかどうかを確認することである。この1年間の研究の成果により、培養中皮細胞を用いたin vitroの実験系において、リンおよびカルシウムの負荷は、細胞外マトリックスへのハイドロキシアパタイトの沈着を促進することが明らかになった。さらに、この石灰化が促進する過程において、培養中皮細胞が骨芽細胞様細胞へ形質変化することがPCRによる遺伝子発現解析の結果明らかになった。一部の形質変化はWestern Blottingによってたんぱくレベルでも確認された。さらに、培養中皮芽細胞において、血管石灰化過程で非常に重要な細胞死もリン負荷の結果起こっていることを明らかになった。動物実験においては、腹膜石灰化の病態モデルの報告が皆無であることを踏まえ、我々が世界に先駆けて腹膜石灰化モデルの作成に新規に着手した。公募研究に応募する前の段階で、腹膜石灰化を部分的に発症する腹膜炎モデルをすでに確立していたが、マグネシウムの抑制効果を確認するのには不十分なモデルであった。このため、腎不全を組み合わせる方法を今回考案した。これまでおこなってきたリポポリサッカライド(LPS, lipopolysaccharide)の腹腔内投与に加えてマウスに片腎摘出の処置を追加したところ、腹膜炎をベースにした腹膜石灰化の程度が一段と増強されることを確認できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 公募研究の初年度の研究は、当初予定していた研究計画がほぼ完遂され、全体としておおむね順調に進んでいる。培養中皮細胞を用いた腹膜石灰化の系は確立され、腹膜石灰化の定性的評価および定量的評価が確実にできるようになっている。今後、培養細胞実験においては、腹膜石灰化が進展する機序をさらに追及するとともに、腹膜構成細胞の石灰化プロセスをマグネシウムの投与が抑制できるかどうかを確認する研究計画を推進する。また、初年度に確認されたリン負荷による培養細胞の細胞死の様式についても解析をさらに進める。さらに、動物実験においては、この1年で確立したマウス腹膜石灰化モデルを用いて、マグネシウムの抑制効果がin vivoでも期待できるのかどうかを検証する。現時点でマウス石灰化モデルは腹膜石灰化を定量的に評価するには不十分であると考えられ、一歩進んで腹膜石灰化がさらに増強できるように追加で炎症や腎不全を同モデルに上乗せる手法を考慮している。さらに、マウスから摘出した腹膜を用いた培養実験を新たに開始し、ex vivoレベルでの実験計画も推進する。腹膜石灰化ができやすいのが臓側腹膜側なのか壁側腹膜側なのか、その差異の背景にある要因を突き止め、腹膜石灰化の進展機構の機序解明につなげていく。
Strategy for Future Research Activity	初年度通り、研究協力者2名との定期的な会合の時間を設け、研究の進捗状況や今後の実験計画の適宜見直しを行いながら、応募当初の計画を推進する。次年度は、腹膜構成細胞として培養線維芽細胞の腹膜石灰化における関与の可能性を追求する実験を推進する。状況次第では血管平滑筋細胞も石灰化の系として導入する。さらに、マウス腹膜の病理組織学的な評価を実施し、腹膜石灰化の詳細な分子メカニズムの解明に着手する。また、剖検で得られたヒト腹膜組織を用いた組織学的評価の可能性についても検討する。そして、CPPをin vitroの系で合成して、CPPによる腹膜構成細胞の直接障害が細胞外マトリックスのハイドロキシアパタイト沈着を惹起しうるのかどうかを解明する研究を進めていく。次年度の研究の大きな柱は、CPPの合成およびCPPによる腹膜傷害の確認、その作用機序の解明になる。CPPの合成は条件調整が非常に難しいことが知られており、今後、CPPの合成経験を持つ研究者に協力を仰ぎ、腹膜石灰化を促進させる機序の解明に使用できる質の高いCPPの合成を目指す。以上の一連の研究をすすめることによって、腹膜石灰化が起こる分子メカニズムの解明を多面的に実施できるよう計画を適宜見直しつつ個々の実験を推進し、2年目のプロジェクトの完遂を目指す。