The structure and production pathway of skin barrier lipid protein-bound ceramide
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22K08372
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53050:Dermatology-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
大野 祐介 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (50611498)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 結合型セラミド / セラミド / 皮膚バリア / 脂質 / スフィンゴ脂質 |
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| Outline of Research at the Start |
皮膚は生体内外の物質の透過を制限するバリアとして機能し，バリア機能の低下／破綻は感染症や皮膚疾患（アトピー性皮膚炎，魚鱗癬）の原因となる。結合型セラミドは皮膚のバリア機能に必須であるが，結合型セラミドの実際の構造（結合様式，結合タンパク質）や産生経路は未だ明らかにされていない。本研究では，マウス表皮，ヒト角質層および表皮角化細胞を用いた包括的な脂質解析とプロテオミクス解析を組み合わせ，結合型セラミドの構造，産生経路の解明を目的に研究を遂行する。さらに本研究では，結合型セラミドの合成アナログの皮膚バリア機能異常疾患治療への応用の可能性を探る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス表皮から遊離脂質を除き，得られた表皮残渣（結合型セラミド画分）をプロナーゼE処理することでタンパク質をアミノ酸レベルまで分解させる実験系の構築に成功した。LC-MS/MSを用いた包括的解析により，プロナーゼE処理産物中に含まれるセラミドとアミノ酸結合体を探索したところ，システイン結合型エステル化ω水酸化セラミドがマウス表皮中に存在することを見出した。システイン以外のアミノ酸が結合したセラミドは検出されず，従来型の結合型セラミドとして知られるグルタミン酸結合型ω水酸化セラミドも検出されなかったことから，これまで存在が知られていなかったシステイン結合型エステル化ω水酸化セラミドが主要な結合型セラミドであることが強く示唆される。
結合型セラミドの前駆体であるアシルセラミドの産生酵素PNPLA1の魚鱗癬誘発ミスセンス変異体の細胞内局在を行ない，変異によるPNPLA1の局在異常が機能喪失の要因の一つであること，また変異ごとに局在異常への影響が異なることを明らかにした。
常染色体潜性先天性魚鱗癬の患者から同定された脂肪酸ω水酸化酵素CYP4F22のナンセンス変異およびミスセンス変異によって産生されるCYP4F22変異体E79*，R397Cではω水酸化活性が消失していることを明らかにした。
セラミドを構成する長鎖塩基の鎖長を規定するセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（SPT）複合体のサブユニットのうち，SPTLC3およびSPTSSBといったC20以上の長鎖塩基の産生に関わる因子の発現が表皮角化細胞の分化に伴って大きく増加することを見出した。酵母において，SPT複合体サブユニットTsc3およびSPT複合体の活性抑制因子Orm1/2には小胞体関連分解タンパク質Dfm1との遺伝的相互作用がみられ，これらの遺伝子欠損株ではセラミド量が変化していることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り，表皮サンプルからのアミノ酸結合型セラミドを調製する実験系，LC-MS/MSを用いた検出系を確立し，アミノ酸結合型セラミドの実体を明らかにすることができた。そのため，おおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
システインとの結合体が検出されたが，他のアミノ酸とも結合している可能性も考えられるため，求核性側鎖をもつアミノ酸との結合性をエポキシエノンセラミド（結合型セラミド前駆体）の合成アナログを用いたアッセイにより調べる。また，システインとの結合に重要な官能基を明らかにするため，エポキシ基，エノン部分を改変したアナログを合成し，結合アッセイを行なう。
野生型マウスの表皮を用いた解析において検出されたシステイン結合型エステル化ω水酸化セラミドが，目的としている分子であること（アーティファクトでないこと）を確定させるため，結合型セラミドが消失したマウスであるCyp4f39ノックアウトマウスの表皮を用いた解析を行ない，Cyp4f39ノックアウトマウスでシステイン結合型エステル化ω水酸化セラミドが消失していることを確認する。
トリプシンまたはプロテイナーゼKを用いた表皮タンパク質を分解させることで，ペプチドと結合した状態のセラミドを調製する実験系を確立し，セラミドに結合したペプチド配列を調べることで，結合タンパク質の同定を行なう。
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Report
(1 results)
Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Ceramide Analysis in Combination With Genetic Testing May Provide a Precise Diagnosis for Self-Healing Collodion Babies2022
Author(s)
Takeichi Takuya, Ohno Yusuke, Tanahashi Kana, Ito Yasutoshi, Shiraishi Ken, Utsunomiya Ryo, Yoshida Satoshi, Ikeda Kenta, Nomura Hayato, Morizane Shin, Sayama Koji, Ogi Tomoo, Muro Yoshinao, Kihara Akio, Akiyama Masashi
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Journal Title
Journal of Lipid Research
Volume: 63
Issue: 12
Pages: 100308-100308
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] An ERAD‐independent role for rhomboid pseudoprotease Dfm1 in mediating sphingolipid homeostasis2022
Author(s)
Bhaduri Satarupa, Aguayo Analine, Ohno Yusuke, Proietto Marco, Jung Jasmine, Wang Isabel, Kandel Rachel, Singh Narinderbir, Ibrahim Ikran, Fulzele Amit, Bennett Eric J, Kihara Akio, Neal Sonya E
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Journal Title
The EMBO Journal
Volume: 42
Issue: 4
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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