| Project/Area Number |
22K08473
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
中尾 眞二 金沢大学, 医学系, 協力研究員 (70217660)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
細川 晃平 金沢大学, 附属病院, 講師 (10786239)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | 発作性夜間ヘモグロビン尿症 / 再生不良性貧血 / PIGA遺伝子 / PNH型血球 / クロナリティ / HLA-DR15 / CD4陽性T細胞 / T細胞レセプター / 自己抗原 |
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| Outline of Research at the Start |
特発性再生不良性貧血（AA）患者のうち、HLA-DRB1*15:01陽性例は、造血能がシクロスポリン依存性になりやすく、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）に移行する頻度が高いことが知られているが、このHLAアレルがAAやPNHの発症にどのように関与するのかは不明である。本研究では、HLA-DR15を欠失した患者のiPS細胞由来造血幹前駆細胞（iPSC-HSPC）と同じ患者の野生型iPSC-HSPCを利用して、HLA-DR15が提示する自己抗原特異的T細胞のレセプター（TCR）を決定し、このTCRのトランスフェクタントを利用して、自己抗原を同定すると共に、PNHクローンの拡大機序を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
PNHクローンの初期増殖のメカニズムを明らかにするためには、健常者でもわずかに存在するglycosylphosphatidylinositol-anchored protein (GPI[-]蛋白)の欠失した顆粒球と、再生不良性貧血患者で検出されるGPI(-)顆粒球との違いを明らかにする必要がある。従来の方法では、0.1％未満という少数のGPI(-)顆粒球を対象としてPIGA遺伝子変異を検出することは困難であったが、我々はDNA抽出を必要としない新しい方法を用いて、磁器ビーズで濃縮したGPI(-)顆粒球を解析した。GPI(-)顆粒球が0.003％未満の健常者6人について100個のGPI(-)顆粒球を調べたところ、中央値で11、範囲が6-18の様々なPIGA変異が検出された。このうち4例について0.003％未満のGPI(-)T細胞を同時に検索したところ、同様に中央値14、範囲6-26の様々な変異が検出された。そのうち1例のGPI(-)顆粒球で検出された2種類のPIGA変異はGPI(-)T細胞でも同定された。顆粒球で検出されたPIGA変異と一致するものは皆無であった。
一方、0.02％から0.5%のGPI(-)顆粒球を保有する再生不良性貧血5例を調べたところ、全体の90-99％を占める大きなPIGA変異クローンが全例で検出された。さらにこれらの5例で検出された0.003%未満（2例）、0.004％～0.008％のGPI(-)T細胞でも90％以上を占める大きなPIGA変異が同定された。以上の結果から、健常者で検出されるGPI(-)顆粒球は多クローン性の細胞集団であるものの、一部に造血幹細胞由来のGPI(-)細胞が含まれていることと、再生不良性貧血で検出されるGPI(-)血球は、それがごくわずかであっても単一または数個のPIGA変異造血幹細胞由来であることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
0.003％未満のごくわずかなGPI(-)血球は、ほとんどの健常者の末梢血で検出されることが 令和4年度の研究で明らかになっていたが、このminiscule GPI(-)血球と、骨髄不全患者で検出される0.003％以上の微少GPI(-)血球にどのような違いがあるかは不明であった。本年度の研究により、miniscule GPI(-)血球が多クローン性細胞集団であるのに対して、骨髄不全患者で検出されるGPI(-)血球は、免疫学的攻撃を免れた少数のPIGA変異造血幹細胞由来のクローン性細胞集団であることが初めて明らかになった。その免疫学的攻撃を明らかにするために、HLA-DRB1*15:01陽性例の中でも、CD4陽性T細胞による造血幹前駆細胞の攻撃が特に強いと考えられる再生不良性貧血症例の血清中に、HLA-DR15が提示するミスフォールド蛋白に対する自己抗体が存在するか否かを、大阪大学荒瀬尚博士との共同研究により検討しているが、現在のところ有力な抗体は同定されていない。iPS細胞由来の造血幹細胞を用いた検討は、当初担当していたベトナム人博士研究員が家庭の事情で帰国したため進んでいない。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．HLA-DR15によって提示される造血幹細胞由来の自己抗原を同定するため、大阪大学荒瀬尚博士との共同研究により、患者の骨髄において抗原特異的に増殖しているCD4陽性T細胞レセプター（TCR）を単一細胞レベルで同定し、そのTCRのトランスフェクタントを用いてHLA-DR15導入K62細胞に対する反応性をスクリーニングする。
２．最近のわれわれの研究により、HLAクラスIアレル欠失血球のみが検出される再生不良性貧血例では、重症例であってもシクロスポリンやTPO-RAのみで改善する例が多い一方、PNH型血球が同時に検出される例では、CD4陽性T細胞による造血幹細胞の抑制が併存しているため、抗胸腺細胞グロブリンによる強い免疫抑制療法が必要で可能性が示された。この仮説を検証するため、臨床試験に登録された症例を対象として検討を続ける。
３．13番染色体長腕の部分欠失（del(13q)は、造血幹細胞の異常というよりは再生不良性貧血における免疫病態のマーカーであることを我々は報告してきた。しかし、del(13q)細胞があると何故免疫抑制療法に反応しやすいのかは不明であった。最近のエルトロンボパグを用いた臨床試験により、del(13q)は再生不良性貧血の10％以上の例に検出され、以前の我々の報告と同様にそれらの例ではPNH型血球の増加を常に伴っていた。このため、del(13q)造血幹細胞は、PNH型幹細胞と同様に、何らかの抗原に特異的なCD4陽性T細胞の攻撃をエスケープしている可能性がある。そこで、13q領域の含まれる遺伝子のうち、GPIアンカー膜蛋白をコードする遺伝子を同定し、末梢血造血幹細胞におけるそれらの遺伝子の発現が低下していないかどうかをモノクローナル抗体を用いて明らかにする。
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Report
(2 results)
Research Products
(5 results)
