化学療法後の白血病再発における骨髄微小環境の解析

• Project/Area Number: 22K08478
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 八尾 尚幸 九州大学, 医学研究院, 助教 (90835282)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 白血病 / 白血病幹細胞 / 白血病ニッチ / 骨髄微小環境

Outline of Research at the Start

急性白血病が再発する原因の一つとして、化学療法時の白血病幹細胞の残存と再増殖であることが知られている。また、骨髄には血球細胞を制御するニッチと呼ばれる特殊な微小環境が存在していることから、白血病幹細胞にも独自のニッチが存在し、化学療法時の白血病幹細胞の抗癌剤抵抗性の獲得や化学療法後の再増殖に関与しているものと考えられる。本研究では白血病ニッチの構成細胞を同定し、それらの細胞による白血病幹細胞の抗癌剤耐性獲得のメカニズムを解明し、メカニズムに基づいた白血病ニッチを標的とした治療法の開発を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

成人急性白血病は、寛解導入達成後の再発症例が多く、長期生存率は依然として低率に留まっている。十分な治療強度を有する化学療法を行っているにもかかわらず再発する原因の1つに、化学療法時の白血病幹細胞 (leukemic stem cell; LSC) の保護と、その後のLSCの再増殖を支持する白血病細胞周囲の微小環境 (白血病ニッチ) の関与が疑われる。白血病ニッチは抗癌剤の曝露により通常時とは大きく異なるサイトカイン分泌や細胞外マトリックス産生が行われていると考えられ、抗癌剤曝露による白血病ニッチの変化と、変容した白血病ニッチとLSCとの相互関係の解明が、化学療法後の白血病細胞の微小残存病変や再増殖の分子機構を明らかにするものと考えている。申請者は白血病モデルマウスに抗癌剤を投与し、投与直後の白血病細胞の残存と、その後の白血病細胞の再増殖を確認し、白血病再発をモデルマウスで再現できた。細胞に分泌型蛍光タンパクを発現させ、蛍光タンパク発現細胞の周囲に存在する細胞が蛍光タンパクを取り込むことで、周囲の細胞を同定するNeighbor labeling法 (Ombrato L. et al. Nat Protoc. 2021) を用いて実験を行った。分泌型蛍光タンパクを発現する白血病細胞でモデルマウスを作製し、抗癌剤投与後の白血病ニッチ構成細胞を同定し、それら細胞の白血病細胞再増殖の支持に果たす役割について解析を行う。白血病ニッチとLSCとの相互関係を解明し、メカニズムに基づいた治療標的の発見を目指して研究を行う。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請者はNeighbor labeling法に必要なシグナルペプチド (signal peptide; SP) 遺伝子とHIVウイルス由来の膜透過性ペプチド (trans-activator of transcription protein; TAT) 遺伝子を融合させた蛍光タンパクmCherryの発現ベクターを作製した。白血病ニッチの解析にあたり、白血病細胞株C1498を移植して作製した白血病モデルマウスとMLL-AF9融合遺伝子を導入して作製した白血病細胞 (MLL-AF9白血病細胞) を移植して作製した白血病モデルマウスの2種類の白血病モデルマウスを準備した。白血病細胞株C1498に同ベクターを遺伝子導入し、C1498細胞でSPとTATの融合したSP-TAT-mCherryタンパクの産生を確認した。マウスに移植したC1498細胞はマウス骨髄に生着し、C1498細胞が分泌したSP-TAT-mCherryタンパクを取り込んだC1498細胞周囲の細胞をフローサイトメトリーで確認できた。また、MLL-AF9白血病細胞にも同様に同ベクターを遺伝子導入し、ベクター導入できたMLL-AF9白血病細胞をフローサイトメトリーで単離してマウスに移植し、SP-TAT-mCherryタンパクを発現するMLL-AF9白血病細胞による白血病モデルマウスを作製した。MLL-AF9白血病マウス骨髄でも、周囲の細胞によるSP-TAT-mCherryタンパクの取り込みをフローサイトメトリーで確認できた。

Strategy for Future Research Activity

抗癌剤投与後、白血病モデルマウス骨髄のSP-TAT-mCherryタンパクを取り込んだ間葉系細胞の細胞数を経時的に確認し、細胞数の変化について解析を行う。SP-TAT-mCherryタンパクを取り込んだ間葉系細胞を既存の細胞表面マーカーで識別できれば、候補となる白血病ニッチ構成細胞でCreを発現するマウスとRosa26-DTR-tdTomatoマウスとを交配させ、ニッチ構成細胞を標識するマウスを作製する。次いで、抗癌剤投与後の残存LSCと白血病ニッチ構成細胞の位置関係や、白血病細胞再増殖期の白血病ニッチ構成細胞の変化についてイメージングで解析する。さらに、同マウスで白血病ニッチ構成細胞のみを除去し、白血病ニッチ構成細胞の欠失により起こる抗癌剤投与後の変化を観察し、白血病ニッチ構成細胞の化学療法後のLSCに果たす役割について解析を行う。白血病ニッチ構成細胞の抗癌剤投与前後の遺伝子発現変化をRNAシーケンシングで確認し、得られた結果から白血病細胞の生存と増殖に貢献する責任分子を同定する。遺伝子改変マウスを用いた実験系で、同定された責任分子の役割を検証し、再発抑制効果を有すると考えられる治療標的の発見を目指す。また、既存の細胞表面マーカーを用いての間葉系細胞の識別が困難である場合には、SP-TAT-mCherryタンパクを取り込んだ間葉系細胞のシングルセルRNAシーケンス解析を行い、白血病ニッチ構成細胞の同定を行う。