An interdisciplinary analysis of CBM signalosome assembly

Research Project

Project/Area Number	22K08484
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
Research Institution	Tokyo University of Science, Yamaguchi
Principal Investigator	篠原久明山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 教授 (10391971)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	B細胞 / シグナル動態 / 免疫応答 / 数理解析 / CBMシグナロソーム / 抗原受容体シグナル / NF-κB / 免疫制御
Outline of Research at the Start	近年の大規模な感染症の流行により,B細胞機能の制御を可能にする分子機序の解明が期待されている.足場タンパクであるCARMA1,BCL10およびタンパク分解酵素MALT1からなる『CBMシグナロソーム』はB細胞活性化シグナルの中心メカニズムであるが,詳細な『CBMシグナロソーム』の形成の分子機序は未だ明らかではない.当課題では『CBMシグナロソーム』の形成を制御可能なタンパク修飾としてユビキチン化の修飾部位とこれを標的とする責任分子を明らかにする.これにより効率の良い感染応答の誘導, 疾患の悪化を抑制し,がん治療の効果を高める具体的な新規分子標的もしくは部位標的の提示に繋がると考えられる.
Outline of Annual Research Achievements	近年の大規模な感染症の流行により、免疫細胞の機能制御を可能にする分子機序の解明が期待されている。足場タンパクであるCARMA1, BCL10およびタンパク分解酵素MALT1からなる『CBMシグナロソーム』はリンパ細胞活性化シグナルの要である。しかしながら、詳細な『CBMシグナロソーム』の制御の機序は未だ明らかではない。当課題では『CBMシグナロソーム』の形成を制御可能なタンパク修飾とその修飾部位を標的とする分子を明らかにしたい。定量解析と生物情報学的融合解析を用いて当課題を遂行することで一分子の抑制 (遺伝子欠損) では理解が及ばなかった生体のシステムによる制御機能が明らかとなる。これにより感染に対する応答、疾患における免疫機能を制御可能にすることが期待される。ユビキチン化酵素であるTRAF6が構造解析から『CBMシグナロソーム』の形成に関わる分子として知られている。そこで、TRAF6欠損させたB細胞株を用いて抗原受容体シグナルに関わる分子の活性化や会合情報を生化学的実験にて定量的に取得し、これまでに構築した速度論モデルの発展・改良を試行しながらコンピュータ解析を行っている。これによりTRAF6は『CBMシグナロソーム』をユビキチン化修飾しシグナルを正に伝達するばかりでなく、転写を介さないフィードバック機構により間接的に『CBMシグナロソーム』を形成する制御に対し抑制的に関わっていることが明らかとなった。『CBMシグナロソーム』の形成に対して負の制御が存在することは示唆されたが、この制御に関わる分子は明らかでない。現在、負の制御がA20を介することを定量実験と速度論的数理モデル解析から推定するに至っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason E3ユビキチンリガーゼであるTRAF6が『CBMシグナロソーム』を協調的に修飾することが示されているが、BCRシグナルによる『CBMシグナロソーム』形成にTRAF6がどのように関与しているかについての詳細は不明であった。本研究では、TRAF6の全エクソンを欠損させたDT40 B細胞を用いて、『CBMシグナロソーム』形成、BCR-NF-κB活性化シグナルを伝達するリン酸化酵素TAK1およびIKKの活性に対するTRAF6の影響を明らかにした。TRAF6欠損細胞では、TAK1活性の減衰とIKK活性の消失、CARMA1のBcl10への結合の持続が確認された。これらの動態を引き起こす分子機構を説明するために、速度論的数理モデル解析を行った。数理モデル解析のシミュレーションの結果、TRAF6によるIKK活性化の制御により、TRAF6消失におけるTAK1およびIKK活性が再現されること、およびTRAF6関連シグナル依存性阻害要素が野生型におけるCARMA1のBcl10への結合を抑制することが検証された。ここまでの結果を論文にて報告した。 TRAF6が、TAK1を介したIKK活性化の正の制御を行うとともに、Bcl10へのCARMA1の結合に対してシグナル依存的な負の制御に間接的に寄与していることを明らかにした。以上の結果と、修正した数理モデルを用いて、TRAF6は短期的にはA20リン酸化を介した負の制御を促進するが、転写誘導は促進しないと推測した。A20リン酸化はTRAF6欠損細胞で抑制された。従って、TRAF6がBCR-NF-κBシグナルのフィードバックシステムを制御し、A20を介したCBM複合体の解離を誘導することを明らかにしようとしている。
Strategy for Future Research Activity	『CBMシグナロソーム』形成に対して負の制御に関わる分子の報告は多数なされている。しかしながら、Bcl10へのCARMA1の結合に対してシグナル依存的な負の制御に寄与している分子の特定は新たな検索を目的とした課題の設定が必要となると思われる。T細胞では、TRAF6は、MALT1と結合することで『CBMシグナロソーム』と会合するが、この会合が正と負の制御に必要であると報告されている。さらにMALT1のユビキチン化に対し脱ユビキチン化酵素A20が抑制的に機能していることも知られている。そこで現時点では、A20に着目し、TRAF6との会合情報や『CBMシグナロソーム』のユビキチン化の定量化情報などを取得し、数理モデルを駆使しながら論理的に『CBMシグナロソーム』形成に対して負の制御を担う分子としての可能性を検討する。