| Project/Area Number |
22K08497
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
長尾 俊景 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (10622798)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 難治性B細胞腫瘍 / 細胞内浸透抗体 / S化CpG-ODN / 抗体-オリゴヌクレオチド複合体 |
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| Outline of Research at the Start |
近年の多様な分子標的治療の発展で、多くの血液がんの治療成績が改善しつつある。一方で一部のB細胞腫瘍は未だ難治性で、腫瘍原性機序や細胞起源に関する基礎研究の進捗にも関わらず、未だ病態特異的治療戦略が確立していない。申請者はこれまで、B細胞腫瘍原性シグナル伝達の解析と共に、新規治療介入法としての新規抗体薬の有用性の検証に従事してきた。本研究の目的は、難治性B細胞腫瘍に対する新たな核酸医薬としての抗体-ODN複合体（AOC）の提案とその検証である。これは従来のAOCと異なり、抗体が細胞内に浸透して標的分子を認識するともに、ODNが細胞内に放出されることで抗腫瘍効果を発揮する、新たなAOCである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度の工程を踏襲し、抗β-アクチン抗体（蛍光色素標識）、特定配列のＳ化ODNを、アフィニティー法を用いてconjugateした抗体薬物複合体（AOC）を試作した。品質の再現性を高めつつ、主に上皮系細胞株を処理し、洗浄の後蛍光色素の細胞内分布を評価した。しかし昨年度の検証同様、陽性対照（細胞内染色によるβ-actin染色）と比較して信号強度は明らかに低く、陰性対照と比較しても有意差を見出せなかった。以上のように、本研究計画の前提の一つである、S化ODNのconjugationによる抗体分子の細胞内浸透（既報）の再現が困難であった。
その一方で、本研究の重要なコンセプトである、TLRs発現B細胞腫瘍に対するTLRs リガンドの抗腫瘍効果については引き続き検証可能であり、計画を一部修正し、細胞表面（TLR4）および細胞内（TLR9）のTLRに対するリガンドと、表面抗原（CD19）に対する抗体とをconjugateし、その抗腫瘍腫瘍作用について検討することとした。まずTLR4あるいはTLR9に対するリガンド（LPSあるいはCpG-ODN）を用いてABC-DLBCL細胞（TMD8）を処理し、その抗腫瘍効果を再検討した。LPS処理はTMD8細胞の増殖を抑制し、その作用はMD-2添加で増強されたが、CpG-ODN処理による効果については再現性が不十分であった。そこで現在、ビオチン化LPSをアビジン化抗ヒトCD19抗体にconjugateする新規AOC（①LPS-CD19抗体）を製作している。またこのAOCの機能解析のプラットフォームとして、TLR4-B細胞リンパ腫モデル：(1)TMD8細胞にヒトTLR4およびCD14を導入した強発現モデル、及び(2)ヒトTLR4、MD-2、CD14、CD19細胞外ドメインおよびMYD88L265P変異体を導入した293細胞の作成が進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上に記載したように、本研究計画進行の前提条件ともいえる細胞内浸透抗体プラットフォーム（S化ODN-抗体複合体の効率的細胞内浸透）の再現が現時点で困難で、その前段階としてS化CpG-ODN自体の細胞内浸透について、改めて検証が必要となってしまっていることが主要な原因として挙げられる。CpG配列の選択や組み合わせ、浸透の有無についての検出方法、試薬の濃度対効果の問題等について引き続き検討することが必要と考える。このため当初の計画の変更・修正を余儀なくされており、本研究計画のもう一つの重要なコンセプトである、TLRに対するリガンドとそのＢ細胞腫瘍に対する抗腫瘍効果、及びそのメカニズムの解析にもより大きなエフォートを割いて検証を進めている。こちらについてはある程度の進捗が得られていると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記した新規AOC①（LPS-CD19抗体）がLPS単体の場合と同様、MD-2依存性にABC-DLBCL細胞の増殖抑制効果を誘導できるか検証する。またそのメカニズムについて上記のin vitroモデル(1)(2)を用いて、主にウエスタンブロット法や定量的PCR法等により検討する。
さらに上記のTLR4-B細胞リンパ腫モデルに加え、TLR9、CD19細胞外ドメインおよびMYD88L265Pを発現させた293T細胞（TLR9-B細胞モデル）の作成や、S化CpG-ODNをCD19抗体にconjugateしたAOC（②S化CpG-CD19抗体）の生成を計画している。これらを用いてCD19発現細胞への新規AOC（②）選択性・結合の確認、およびTLRs/MYD88以下の経路の活性化への影響を同様に検討する。
一方、既報の内容に一致してS化CpG-ODNの細胞浸透性が改めて確認できれば、当初の研究計画に沿った従来のコンセプト（S化CpG-ODNと細胞内分子に対する抗体のconjugation）についても計画するが、使用可能な予算・エフォート・研究期間には限りがあり、上記の新規AOC（①および②）の計画の進行状況によっては、そちらにより集中的にエフォートを配分するなど、研究計画を適切に修正し運用する。
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