| Project/Area Number |
22K08499
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
大石 沙織 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (50894094)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 克枝 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (10324211)
築地 長治 山梨大学, 大学院総合研究部, 講師 (20710362)
佐々木 知幸 山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (40739124)
白井 俊光 山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (50710381)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 血小板 / CLEC-2 |
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| Outline of Research at the Start |
血小板活性化受容体CLEC-2は, マウスでは血栓の安定化, 腫瘍の転移促進などに関与する 一方, 生理的な止血への関与は少ない. 抗CLEC-2薬は出血リスクの少ない抗血栓薬・抗転移薬として期待されるが, ヒトCLEC-2の機能は十分に解明されていない. 本研究では, ヒトCLEC-2の止血・血栓形成における役割の解明を目的とし, 成熟後に血小板を生成できるヒトiPS細胞由来巨核球細胞株にゲノム編集を施すことで, CLEC-2欠損ヒト血小板を生成する. 「CLEC-2欠損ヒト血小板」と「ヒト由来の赤血球・血漿」を併せreconstituted血液を作製し, 止血・血栓形成への影響を解析する.
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| Outline of Annual Research Achievements |
imMKCLに対するゲノム編集について情報収集を行ったところ、imMKCLに直接ゲノム編集を施すと血小板産生量が低下するため、iPS細胞へのゲノム編集が望ましいということが分かった。そこで、京都大学iPS研究所より、imMKCLからre-reprogrammingされたMK-iPS細胞を譲渡していただき、ゲノム編集を行う方針とした。
CRISPR-Cas9によりCLEC1B遺伝子をノックアウトするにあたって、適切なgRNA標的部位を推定するため、予備検討を行った。Full length、exon3を欠失、exon3-4を欠失させたCLEC1Bの発現ベクターを作製しHEK293細胞で発現させたところ、完全に細胞外への表出をなくすにはexon3-4を欠失させるのが望ましいことが判明した。そこで、exon3およびexon4にgRNA標的配列を設定することとした。
gRNA標的配列の候補を複数設定しgRNAを合成した。各gRNAのゲノム編集効率を評価するため、個別にMK-iPS細胞にトランスフェクションし、バルクでのゲノム編集効率解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度に、別のプロジェクトを早急に行う必要性が生じ、本プロジェクトへの着手が予定よりも遅れたこと、またこれまでに使用経験のない新規の細胞を導入することになったため、予定よりも進捗が遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、単一のgRNAを用いてゲノム編集を行い、バルクでの編集効率解析を実施している。今後は最適なgRNAの組み合わせを決定した上で、複数gRNAでのゲノム編集、サブクローニング、コロニー培養、ゲノム回収の上、株ごとの配列確認に進む予定である。CLEC1BKO MK-iPSが得られた後には、京都大学iPS研究所にimMKCLへの分化培養を依頼する。CLEC1BKO imMKCLより血小板を得て、機能解析に進む。
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