ゲノム編集を利用したKRAS変異骨髄腫に対する新規治療標的薬の探索

Research Project

Project/Area Number	22K08516
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 54010:Hematology and medical oncology-related
Research Institution	Aichi Medical University
Principal Investigator	花村一朗愛知医科大学, 医学部, 教授 (70440740)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	太田明伸愛知医科大学, 医学部, 講師 (30438048) シバスンダランカルナン愛知医科大学, 医学部, 講師 (30557096)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	骨髄腫 / RAS / ゲノム編集 / 阻害剤 / 標的治療 / CRISPR-cas9
Outline of Research at the Start	骨髄腫は、治癒不能なため新しい治療が必要である。KRAS変異は、骨髄腫患者の約2割で認められる腫瘍増悪因子であるが特異的治療はない。我々は、独自に、野生型KRASを活性型KRAS変異に改変したヒト骨髄腫細胞株を樹立した。本研究の目的は、骨髄腫におけるKRASネットワークの解明と、KRAS変異骨髄腫に対する新規候補薬の創出である。本研究では、すでに樹立した活性型KRAS変異改変細胞と野生型KRAS親細胞を用いて、マイクロアレイや化合物ライブラリーなどで比較解析を行い、KRASネットワークや候補阻害剤を探索する。本研究は、KRAS変異を持つ多くのがん治療に応用が可能で、波及効果は極めて大きい。
Outline of Annual Research Achievements	CRISPR-Cas9ゲノム編集術を用いて、ヒト骨髄腫細胞株Sachiの野生型KRASを、KRAS G12A変異などに改変した細胞クローンを独自に樹立した。活性型KRAS変異改変細胞とKRAS野生型の親細胞とで、MTTアッセイやコロニー形成アッセイを行い、活性型KRAS変異改変細胞で細胞増殖能やコロニー形成能が亢進していることを確認した。活性型KRAS変異改変細胞とKRAS野生型の親細胞とで、cDNAマイクロアレイとGSEA（gene set enrichment analysis）を行い、両者間で有意な発現変化を認める遺伝子を100以上特定した。これには、未報告のRAS関連遺伝子も多く含まれていた。特に、骨髄腫細胞の生存や増殖に関連すると予想される未報告分子の発現レベルの差は、RT-PCRやwestern blotにより検証した。さらに、阻害剤ライブラリーを用いて、活性型KRAS変異改変細胞に対して、より阻害度合いが高い候補化合物を、複数特定した。このように、本年度は、骨髄腫における新規KRAS関連分子のほか、KRAS変異骨髄腫に効果が期待できる候補阻害剤が特定できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 骨髄腫における新規のKRAS関連分子のほか、KRAS変異骨髄腫に効果が期待できる候補阻害剤が特定できたため。
Strategy for Future Research Activity	阻害剤ライブラリーにより特定した候補阻害剤の効果を、複数の骨髄腫細胞株を用いて、KRAS変異のほか、NRAS変異、BRAF変異の有無との相関を検討する。KRAS変異骨髄腫細胞に対する殺細胞効果が、高いと推定できる候補阻害剤については、その薬理機序や、他の抗骨髄腫薬との併用効果を検討する。同時に、活性型KRAS変異改変細胞とKRAS野生型の親細胞間のcDNAマイクロアレイ遺伝子発現解析から、骨髄腫細胞におけるKRASネットワークを想定し、KRASネットワーク阻害に効果的な化合物も探索する。