| Project/Area Number |
22K08554
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54020:Connective tissue disease and allergy-related
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
白井 悠一郎 日本医科大学, 医学部, 講師 (70528801)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 強皮症 / 石灰沈着症 / 骨芽細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
強皮症(systemic sclerosis; SSc)で見られる皮下石灰沈着症の分子機序の解明と治療標的探索を目的とする研究である。申請者は先行研究において、SSc患者の石灰沈着病変摘出検体では骨芽細胞様細胞が異所性に存在し、培養系で石灰成分を持続的に産生しうることを見出した。そこで今回は、①患者から採取した滑膜、腱等の組織を用いて骨芽細胞に分化させ、石灰成分を産生するかを確認し、病態を再現すること、②石灰沈着組織中に存在する骨芽細胞様細胞の特性を解析すること、③石灰沈着組織の培養系に治療薬を添加し、作用機序を明らかにすることの3点を取り組む。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、全身性強皮症における異所性の石灰沈着症の機序解明を目的としている。今年度は、臨床現場で全身性強皮症の石灰沈着症に対する治療薬として使用されているジルチアゼム、プロベネシド、ミノサイクリン、コルヒチンの4つを用意し、間葉系幹細胞からの骨芽細胞誘導の培養系に複数の濃度を振って、石灰誘導の阻害効果を検討した。予め細胞毒性試験でviabilityを確認した上で添加濃度を検討し、前3剤は0, 1, 5 ug/mLで、コルヒチンのみ0, 0.2, 1 ng/mLとした。評価項目の一つは石灰誘導の有無は半定量的にアリザリンレッドS染色の吸光度測定とした。もう一つは、骨芽細胞のカスケードの上流であるRUNX2、およびその下流であるALP、BGLAP（osteocalcin）、type I collagen、SPP1（osteopontin）の合計5種類の遺伝子発現の量を定量的PCRで評価し、GAPDHとの比で算出した。その結果、ミノサイクリンでは、BGLAPを除いて濃度依存的な阻害効果が見られた。ジルチアゼム、プロベネシドは明らかな阻害効果は見られず、コルヒチンは細胞のviabilityがやはり低く、さらなる条件検討を要した。
また、今回は石灰沈着症を有する患者から石灰沈着が付着している組織の切除検体を1件採取した。検体摘出時、組織の断面からスタンプ標本を作製したところ、アリザリンレッドSで染色され、リン酸カルシウム成分であることを確認した。また、パラフィン標本を作製し、HE染色したところ、ヘマトキシリン陽性の結晶の近傍に、小型の単核球が集簇していることを確認した。また、この組織は摘出後直ちに培養し、石灰化を自発的に産生する細胞群の増殖をさせ、一部は培養を残し、残りの大部分は保存している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究の最終段階での解析に必要な患者由来のex vivo検体は、症例が少なく、手術を必要とするため、そのような症例の組織を得るのに時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
①間葉系幹細胞を用いた培養系では、石灰化誘導（5種類の遺伝子発現、アリザリンレッドS染色で検証）に対する4種類の薬剤の条件検討を確定し、3種類の間葉系幹細胞株で最終的に検討する。②手術検体は、石灰沈着を伴う組織と伴わない組織の2群に分けて採取する。各部位からmRNAを抽出してRNA seqで遺伝子発現レベルを比較する。③手術検体から樹立した培養系を設定し、①で検討した治療薬を添加して石灰沈着が抑制できるか、またその機序を検討する。
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