| Project/Area Number |
22K08595
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54030:Infectious disease medicine-related
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
吉河 智城 国立感染症研究所, ウイルス第一部, 主任研究官 (20399463)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 組換え法 / ワクチン / ウイルス / ワクシニア / LC16ｍ8 |
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| Outline of Research at the Start |
日本で高度弱毒化痘そう生ワクチンとして承認されているワクシニアウイルス LC16m8株（m8）について、安全性の更なる向上と、m8内に複数の外来遺伝子を挿入した多価ワクチンとして利用する時の増殖能低下の改善は重要である。そこで本研究はm8の増殖能とワクチンとしての免疫原性に必須な遺伝子と必須で無い遺伝子を網羅的に同定することを目的とする。同定した非必須遺伝子はm8から除去可能であり、予期せぬ副反応の予防、つまり安全性の向上に繋がる。更に非必須遺伝子は外来遺伝子への置換が可能となり、外来遺伝子を複数挿入した際に生じる増殖能への影響を最小にすることが期待できる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
痘そうワクチン株LC16m8の全ゲノムを保持するbacterial artificial chromosome (BAC)、pLC16m8-BACに導入するトランスポゾンを設計し、その評価を行った。トランスポゾンは大腸菌で薬剤選択を行う為のアンピシリン耐性遺伝子と、トランスポゾンが挿入された際に大腸菌のコロニーを蛍光で選択するための蛍光タンパク質遺伝子であるmScarlet遺伝子にて構成されるものとし、これらの遺伝子を保持するプラスミド、pAmp-9mScarletの作製に成功した。当初mScarlet遺伝子はワクシニアウイルス特異的なプロモーターで発現することを計画していたが、この場合トランスポゾンの挿入によって、このプロモーターの下流で予期しない遺伝子発現が生じる可能性があった。そこでワクシニアウイルス特異的なプロモーターによる制御では無く、大腸菌のプロモーターによる制御に変更した。作製したpAmp-9mScarletからトランスポゾンを作製する前に、これら二つの遺伝子を用いたBACプラスミドの組換え効率を検討するべく、pAmp-9mScarletを一般的なBACプラスミドの組換えに使用したところ、組換えが生じた大腸菌は想定通りにアンピシリン耐性を獲得し、更にLEDトランスイルミネーターを用いることで赤色の蛍光を発することが確認された。以上よりpAmp-9mScarletから作製するトランスポゾンは、トランスポゾンが導入された大腸菌の選択に於いても威力を発揮することが期待できる結果となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は薬剤感受性と蛍光遺伝子の発現により、pLC16m8-BACへの導入の有無が容易に確認可能なトランスポゾンの作製に成功した。薬剤感受性遺伝子による大腸菌の選択は非常に簡便かつ有効な手段である一方で、しばしば擬陽性の大腸菌コロニーが出現するという難点も存在する。今回作製したトランスポゾンは抗生物質耐性遺伝子を用いた薬剤による選択だけで無く、蛍光遺伝子の発現による選択が加わっている。これにより擬陽性の出現を大きく減少させることが予備試験でも明らかとなっており、今後の実験の推進に大きな威力を発揮すると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定通り、pLC16m8-BACに本年度作製したトランスポゾンを挿入する。アンピシリン耐性遺伝子とmScarlet遺伝子の発現により選択すれば、出現したコロニーからトランスポゾンを保持する様々な変異プラスミドが回収できる。トランスポゾンの挿入は1コピーのプラスミドあたり1つ入るようにし、500クローン程度の変異プラスミドを得るようにする。
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