| Project/Area Number |
22K08605
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54030:Infectious disease medicine-related
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
井坂 雅徳 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (40336673)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前山 順一 国立感染症研究所, 次世代生物学的製剤研究センター, 主任研究官 (40199641)
立野 一郎 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (50311642)
矢木 宏和 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 准教授 (70565423)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | A群連鎖球菌 / 糖鎖結合タンパク質 / 免疫回避 / セレクチン / CD162 / インテグリン / マクロファージ / 貪食能 |
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| Outline of Research at the Start |
A群連鎖球菌は、劇症型と呼ばれる敗血症性ショックを引き起こし、それに至る原因は、いまだに解明されていない。この細菌は、表皮と真皮の間に留まり移動し、好中球などの免疫細胞が患部へ浸潤せず働いていないことが先行研究により明らかとなっている。
我々は劇症型株の培養上清から好中球浸潤を抑制する糖タンパク質を新たに見出した。そこで本研究はA群連鎖球菌が分泌する糖タンパク質のセレクチン阻害による免疫回避機構を解明する。この糖タンパク質の機能解析結果より、糖鎖を標的とした抗体治療薬の開発に向けた研究を行い、今後の臨床応用へと展開させていく。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はA群連鎖球菌が分泌する糖タンパク質による免疫回避機構を解明しています。この研究では、A群連鎖球菌が分泌する糖タンパク質がセレクチンを阻害することで浸潤が抑制すると考えています。糖タンパク質が浸潤阻害を行うことを証明するために、１）糖タンパク質の精製、２）免疫細胞とのインタラクション、３）糖鎖構造の解析、４）合成した糖鎖による免疫細胞とのインタラクションの４つの段階を考え、順番に研究を実施してきました。本年度は糖鎖タンパク質と免疫細胞とのインタラクションや、糖タンパク質の糖鎖構造の解析に着手し、その結果を得ることができました。免疫細胞として、動物由来の細胞の前に、培養細胞のHL-60を用いてアッセイ系を確立させました。HL-60にレチノイン酸を添加させることにより、好中球に類似した細胞へ分化させることが確認できました。この細胞にフォルボールエテルを作用させて過酸化水素を細胞内に発生させることが出来ました。このことから、HL-60が好中球へ分化し、貪食能力を持った細胞を得ることがわかりました。上記のHL-60細胞と精製糖タンパク質との反応では、発生させた過酸化水素の抑制を、劇症型由来の糖タンパク質では観察されました。従来からの咽頭炎株では抑制が見られませんでした。精製糖タンパク質を、レクチンを用いてブロッティング解析を実施しました。その結果、ルイスXに相当する糖鎖を保持している事が明らかとなりました。精製した糖タンパク質の糖鎖構造を質量分析で解析しました。通常の質量分析による方法では、ペプチドのデータベースによりプロテオーム解析を実施することになり、糖鎖情報が得られません。今回は精製糖タンパク質の切断後に糖を保持したペプチドを精製濃縮し、その後に質量分析を実施しました。その結果、未知の糖鎖が結合した糖鎖を持っていることが明らかとなりました。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在精製糖タンパク質のグリコオーム解析を実施し、複数のデータを得ています。このデータからどのような糖鎖が存在しているかを解析しています。現在の質量分析によるタンパク質の解析より、ペプチドのデータベースがすでに存在しています。一方、糖鎖のデータベースで、特に原核細胞の糖鎖データベースが存在していないため、得られたデータを目測で解析をしております。また、得られたデータから、糖鎖に糖以外の物質が結合していることが判明しました。糖鎖以外の物質のデータの場合、その物質がそもそも何かわからないために、解析に時間に時間がかかっております。この未知物質が劇症型株だけに存在しているかを、詳細に調査しております。
HEK293細胞の培養系と、その細胞内でのタンパク質の発現系については、さらなるリガンドの候補を探しております。この細胞の培養系は出来上がりましたので、リガンドを発現させるプラスミドを導入して、タンパク質の発現の確認をします。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在進めている糖鎖の質量分析において、未知物質のデータが定まっておりません。原核細胞での糖鎖構造を知る上で、ヘリコバクター属などの先に調査からのデータを参考にして、プログラムの変更などを実施する予定です。また、HL60細胞を用いた結果を元に、ガレクチンなどの糖鎖結合蛋白質とのインタラクションを実施し、さらなる免疫反応との接点を見出したいと思っております。
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