| Project/Area Number |
22K08620
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 54040:Metabolism and endocrinology-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
桜井 賛孝 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70748376)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | インスリン分泌 / 糖尿病関連遺伝子 / ユビキチン / 膵β細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
近年のヒトゲノムワイド関連解析の結果、様々な人種・地域における2 型糖尿病の疾患感受性遺伝子が同定されている中で、2010年に東アジア人でのみ有意な2型糖尿病遺伝子としてUBE2E2が報告された。UBE2E2はユビキチン修飾系においてユビキチンのキャリアー蛋白として機能する種々のE2の中の一つであるが、その機能に関しては明らかでない点が多く、特に糖代謝制御における役割は全く不明である。そこで、膵β細胞特異的UBE2E2トランスジェニックマウスとUBE2E2全身ノックアウトマウスを作製し表現型を解析することで、膵β細胞や各組織でのUBE2E2の役割や糖尿病との関連を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
【背景と目的】
多くのGWASにより2型糖尿病遺伝子としてUBE2E2が報告され、一部の領域(rs13094957)ではリスクアリル保因がβ細胞での発現増加と関連していた。ユビキチン修飾系はE1、E2、E3による翻訳後修飾系である。UBE2E2はユビキチン修飾系のE2ファミリーの一つであるが、耐糖能異常との関連は不明である。そこで、発生工学的手法を用いて膵β細胞特異的UBE2E2トランスジェニックマウス(TGマウス)とUBE2E2全身ノックアウトマウス(KOマウス)を作製し、その表現型を解析することで膵β細胞や各組織でのUBE2E2の役割、ひいてはユビキチン修飾系と糖尿病の関連を解明することを目的とした。【方法】マウス膵島のmRNA由来のcDNAをもとにUBE2E2蛋白をコードする領域をクローニングし、RIPプロモーター下に配置したコンストラクトを構築しTGマウスを作製した。またexon2の領域にsgRNAを設計してCRISPR-Cas9システムを用いてKOマウスを作製した。【結果】TGマウスは若週齢時よりβ細胞量の低下に伴うインスリン分泌低下の表現型を呈した。また、細胞周期関連因子のp21遺伝子の発現高値と、若週齢時や高脂肪食負荷時のβ細胞の増殖能の低下も認めた。プロテアソーム阻害剤処理後のプロテオーム解析では種々のポリユビキチン鎖形成の有意な増加を認め、さらに、阻害剤あり/なしのいずれの条件のプロテオーム解析においても有意に発現増加していたE3リガーゼとしてNedd4が検出された。ヒトのリコンビナント蛋白を用いたユビキチン化アッセイではUBE2E2を介したNedd4によるポリユビキチン鎖の形成が示された。また、作出したKOマウスに関しては、代表的臓器として肝臓においてUBE2E2がKOされていることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
このTGマウスは、インスリン分泌低下による糖負荷後高血糖を呈しており、個体としてのβ細胞量の低下が主な要因だと考えられた。TGマウスの単離膵島を用いて種々の遺伝子発現の評価を行ったところ、アダルト期だけでなく離乳期以前や高脂肪食負荷後においても、細胞周期関連因子であるp21遺伝子の発現が有意に高かった。一般的に通常状態においては、p21は細胞増殖抑制、アポトーシス促進に関与することが知られている。アダルト期のTGマウスの単離膵島において、Bax遺伝子の発現が有意に高かったものの、streptozotocin (STZ)を100 mg/kg BWで腹腔内注射した後のTUNEL染色ではTGマウスと野生型マウスのβ細胞における陽性率は同等であり、アダルト期や離乳期以前、高脂肪食負荷後の膵島においてもTUNEL染色の陽性細胞率に有意な差を認めなかったため、TGマウスのβ細胞量の低下の機序としてアポトーシスは主な要因ではないと考えられた。一方で、離乳期以前や高脂肪食負荷後のTGマウスの膵島においてBrdU陽性β細胞の割合は有意に低下しており、β細胞が増殖すべき状況で増殖能が低下していることが示唆された。単離膵島を用いたプロテオーム解析の結果、プロテアソーム阻害剤あり/なしのいずれの条件においても有意に発現増加していたE3リガーゼとしてNedd4が検出された。直接の相互作用を検証するため、ヒトのリコンビナント蛋白を用いたユビキチン化アッセイを行った結果、UBE2E2を介したNedd4によるポリユビキチン鎖の形成が示された。
また、UBE2E2KOマウスに関しては、germline transmissionの確認を行い、代表的臓器として肝臓においてUBE2E2がKOされていることを確認した。表現型解析に必要な匹数を確保するための交配を進めており、予定通りに進捗していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
リコンビナント蛋白を用いたユビキチン化アッセイではUBE2E2を介したNedd4によるポリユビキチン鎖の形成が示された。しかしながら、Nedd4に関しては、基質として多くの分子が報告されており種々のシグナル経路に関与していることも明らかになっている。膵β細胞におけるUBE2E2-Nedd4を介したユビキチン修飾系の異常が、TGマウスの膵島で認められたp21遺伝子の発現高値やβ細胞量の低下に対して、どのように関与しているのかという点に着目して解析を行う。UBE2E2KOマウスに関しては、マウスの匹数の確保が出来次第、耐糖能の評価を中心に表現型の解析を進める方針である。
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