がん関連マクロファージを標的化したCTRP13発現ウイルスを用いた新規治療法開発

• Project/Area Number: 22K08649
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 54040:Metabolism and endocrinology-related
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 松村 繁 名古屋大学, 医学系研究科, 特任講師 (60523511)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 腫瘍溶解性ウイルス / 腫瘍関連マクロファージ

Outline of Research at the Start

様々な腫瘍において、TAMは様々な亜群に分類されることが、１細胞-RNAシークエンス解析により明らかにされてきたが、免疫抑制性のM2-TAMが主要群であることも再確認された。マクロファージを利用するがん免疫療法としては、がん細胞に高発現している「don’t eat-meシグナル」であるCD47を標的とした治療法が治験研究中である。しかし、これはマクロファージによる貪食を促進する戦略であるが、マクロファージ自体には働きかけない治療法である。本研究の作業仮説は、M2-TAMを標的としウイルスとcGAMPを用いて直接働きかけることで、腫瘍内微小環境を打破できるかというものである。

Outline of Annual Research Achievements

本年度、M2腫瘍関連マクロファージ（M2－TAM）を標的化するため、既に報告のあったCD36に結合するペプチドを発現する遺伝子カセットをウイルスに搭載することを計画し進めた。このペプチドは5Aペプチドと呼ばれ、apoA-Iを模倣したペプチドであり、CD36のoxLDLの取り込みを阻害することが報告されている。また加えて、M2-TAMに高発現し、免疫抑制性の遺伝子発現に関与すると報告のあるCD206、SIRPalphaに対する阻害ペプチドを組み合わせて使用することを計画した。即ち、３つのペプチドを2A配列でつないだものを、HSV1のγ34.5領域に挿入するプラスミドの構築を行った。マーカー遺伝子としてGFP-NLSがIRESでつないであり、これを指標としてウイルス作出を行っている。一方で、HSV1に加えて、当研究室では腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（VACV）を扱うこととなった。そこで、VACVおよびHSV1のマクロファージで及ぼす影響について検証を行った。まずin vitroで骨髄細胞よりM-CSFにて誘導したマクロファージをM0として、LPSでM1誘導、IL4でM2誘導を行いそれぞれにウイルスを感染させて観察を行った。HSV1の感染は見られるものの、マクロファージ細胞は生き残った。ところが、VACVを感染させたところ、ほぼ100%の感染効率を示すとともに、全ての細胞が死滅した。弱毒化されたVACVにおいても、死滅したことからアポトーシスを誘導した可能性が考えられる。実際、マウス腫瘍組織へのVACV投与においても、腫瘍内浸潤マクロファージ（TAM）の数は減少していた。この性質を利用すれば、腫瘍内浸潤M2-TAMを減少させ、その後のM2-TAMの再誘導を３つのペプチド発現により抑制できるのではないかと考えている。そこで、3ペプチドを発現するVACVも作出することを計画している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CTRP13で見られた効果は、少し手法を変えただけで効果が見られなくなってしまった。そこでCD36、CD206、SIRPαの３つの細胞表面受容体を阻害できると報告のあるペプチドを合わせて腫瘍溶解性ウイルスに搭載する計画を遂行しているところである。ウイルスの作出にもう少し時間がかかりそうである。また同時にHSV1とは別にVACVに搭載することも計画しており、ターゲットプラスミドの構築に入っている。CTRP13から方針変更した分がやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

やや遅れている分を取り返すべく、ウイルス作出精製分離を中心に進めていく。また、ペプチドの効果を見るのに発現カセットを用いて293T細胞の培養上清を用いることを検討している。しかし、ペプチドの作用する濃度を条件検討するために、ペプチド合成を行うことも検討している。また、作出したウイルスを感染させた細胞の培養上清もしくは感染細胞とマクロファージの共培養を行い、M2-TAMに与える影響について検討していきたい。また、作出したウイルスを用いてマウス腫瘍モデルにおける腫瘍増殖曲線の検証を行う。また、マクロファージのVACVでの死滅の原因もアポトーシスであるのか検証を行う計画である。