Cas9発現iPS細胞を用いた機能特化型肝再生による、革新的肝不全治療の開発

Research Project

Project/Area Number	22K08716
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	森田和豊九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (00608862)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	吉住朋晴九州大学, 医学研究院, 教授 (80363373) 原田昇九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (80419580) 伊藤心二九州大学, 大学病院, 講師 (90382423) 栗原健九州大学, 大学病院, 助教 (50823598)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	iPS細胞 / Cas9 / 肝細胞 / 機能特化型肝再生
Outline of Research at the Start	①iPSCs-Cas9を肝細胞(iHeps-dCas9) に分化させ、遺伝子の発現を調べ、iHeps-Cas9において発現が低い遺伝子をリストアップする。 ②標的遺伝子に対するガイドRNAを導入して、遺伝子を活性化する。 ③活性化したiHepsを免疫不全動物モデルに移植し、機能を解析する。 ④活性化したiHepsを血管内皮細胞などと共培養し、ミニ肝組織を作成する。
Outline of Annual Research Achievements	現時点では、iPS細胞から機能的に完全な肝細胞を誘導する方法は開発されていない。dCas9-SAM-sgRNAシステムは標的遺伝子の転写を強力に活性化するため、dCas9-SAMを発現するiPS細胞 (iPS-dCas9-SAM) を肝細胞に分化させ、特定の遺伝子に対するガイドRNA (sgRNAs) を導入すれば、その機能に特化した肝細胞を作ることができ、尿素サイクル異常症など特定の機能を低下・欠失した疾患の治療法につながる可能性がある。まずiPS-dCas9-SAMの培養を開始した。培養する過程においてiPS細胞が線維芽細胞様に分化する傾向にあったが、安定培養に成功した。その後、iPS細胞から肝細胞に分化させる過程で、内胚葉細胞のマーカーであるSox17の発現をRT-PCR、蛍光免疫染色を用いて確認した。iPS細胞マーカーであるOct4の発現が低下しているのを同様にRT-PCRで確認した。次に肝細胞に分化させ、HNF4α、FOXA2、CEBPBの発現をRT-PCR、蛍光免疫染色を用いて確認した。尿素サイクルにはOTC、CPS1、ASS、ASL、ARG1等の因子が関わっているため、これらの発現がiPS由来肝細胞でどれだけ発現しているか検討した。人から単離された肝細胞と比べて、mRNAの発現をRT-PCRを用いて検討したところ、OTC:0.0015倍、CPS1:0.07倍、ASS:0.18倍、ASL:0.07倍、ARG1:0.0004倍の発現であった。これらの遺伝子発現を活性化するためにsgRNAを設計検討している。ガイドRNAの導入方法として、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルス法などを比較検討している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason iPS細胞の安定培養の確立にやや時間を要したため。ガイドRNAの設計検討や導入方法の条件設定に時間を要しているため。
Strategy for Future Research Activity	iPS由来肝細胞において、正常肝細胞よりも発現が低下している遺伝子をリストアップする。これらの標的遺伝子に対するガイドRNAを設計検討する。ガイドRNAの導入方法として、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルス法などを比較検討する。ガイドRNAの導入によって、機能的成熟度を高めることを目指す。また導入後は一つ一つの遺伝子の発現をRT-PCRで検討し、最終的には5つの遺伝子の同時活性化、urea assayを用いて、尿素サイクルが十分に活性化されていることを検証する予定である。