| Project/Area Number |
22K08734
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
池本 哲也 徳島大学, 病院, 教授 (20398019)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安友 康二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (30333511)
山田 眞一郎 徳島大学, 病院, 特任助教 (30579884)
齋藤 裕 徳島大学, 病院, 講師 (50548675)
森根 裕二 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 准教授 (60398021)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 脂肪由来幹細胞 / IPC / 1型糖尿病 / 自己免疫 / 細胞運命 / insulin-producing cell |
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| Outline of Research at the Start |
研究代表者らが研究を進めている「自己脂肪由来の脂肪由来幹細胞からの2-step/3次元培養によるinsulin-producing cell自家移植」の１型糖尿病に対する治療戦略は、実臨床応用に際し、「自家移植であるが、果たして自然免疫の影響を受けないのか」、また、「自己免疫疾患である1型糖尿病患者の自己免疫にさらされた場合の細胞運命はどうなるのか」、という学術的問いに回答する必要がある。これらに回答するために、これまで明らかでなかったIPCの自然免疫に対する反応を詳細に検討するとともに、1型糖尿病に移植された新生β細胞集団の細胞運命を明らかとすることを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、自己脂肪由来幹細胞から分化誘導された人工β細胞が、本来のβ細胞に対する自己免疫疾患（1型糖尿病）の患者に移植された際にどのような細胞運命を辿るか、という科学的問いに端を発している。本研究の基となるコンセプト（自己脂肪の脂肪由来幹細胞:ADSCから分化誘導されたinsulin producing cell: IPC移植）は、１型糖尿病患者に対する大きな福音となる可能性がある一方で、アロ移植免疫から免れたとしても、人工細胞であるために、自然免疫に排除されたり、自己免疫によって破壊を受ける可能性は残る。このため、本研究によって、繰り返し移植が必要であるのか、また、免疫抑制を考える必要があるのか等の検討を引き続き行うこととした。この状況を検討するにあたり、Auto-transplantationモデルとして、1型糖尿病自己免疫疾患モデルマウス（NODマウス）を用い、糖尿自然発症したマウスの皮下脂肪からADSCを分離精製し、NOD-IPCを作成する。マウス血糖を正常化するのに十分なNOD-IPC(2.0 x 10^6個)を1型糖尿病自然発症したマウスの腎被膜下へ移植し、全身状態および血糖を測定し、血糖正常化が得られた個体は30日で移植腎の摘出を行い、血糖の再上昇を確認し（移植NOD-IPCが血糖正常化に関わることを示す）、組織学的検討（免疫組織学的染色、リンパ球解析）を行うこととした。更に、長期間（60日）の観察と血糖変動を測定し、その後経時的に犠死を行ってgraftに対しては抗インスリン抗体、PDL1発現、ZnT8発現・リンパ球浸潤の発現を計測・免疫組織化学染色のImage Jを用いた定量化を行い、血中抗体価との相関を検索することとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記の自己免疫性糖尿病を自然発症したNODマウスに移植を行うモデル（auto-transplantation)モデルを完成させ、NOD-IPC移植後の血糖の正常化を確認した。また、30日目（短期間）、60日目（長期間）までの全身状態・血糖観察を行い、適宜犠死させて移植IPCの免疫化学染色を行い、検討を行った結果、移植されたNOD-IPCは自然免疫およびアロ移植免疫によるグラフト排除は考慮しなくてよいものの、長期（移植後60日）になると移植されたNOD-IPCはリンパ球浸潤を受け、NOD-IPCのインスリン発現も低下することから、インスリン分泌能を消失する可能性が示唆された。ただし、全く影響を受けない個体もあり、本治療戦略が非常に有効であるグループが存在する可能性も同時に示唆された。この機序としては、分化誘導終了直後にNOD-IPCにPDL1が強発現していること、GAD65についてはNOD-IPC分化誘導終了直後には発現を認めないが、移植後徐々に発現上昇を認めることから、表面自己抗原の発現とPDL1およびGAD65発現制御がその鍵となるものと考えられた。また、IPCの分化誘導過程において、7日毎に表面抗原の検索（FACS)およびCCK-8アッセイを行い、その抗原性獲得の時期についても検討終了しており、概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究結果から、脂肪組織由来ADSCから分化誘導されたIPCは、分化誘導終了直後にPDL1が強発現していること、GAD65については分化誘導終了直後には発現を認めないが、移植後徐々に発現上昇を認めることから、表面自己抗原の発現とPDL1およびGAD65発現制御が自己免疫に係る排除の鍵となるものと考えられたため、今後、IPCのPDL1およびGAD65の発現について、発現時期およびそのmaster regulatorの同定と抗原性獲得に関する機序解明を目指す。また、併せて、Auto-transplantationの長期間観察（200日）を行い、全く影響を受けない（NOD-IPCが排除を受けない）個体の免疫学的特性の解析を移植後NOD-IPCの抗インスリン抗体、PDL1発現、ZnT8発現・リンパ球浸潤および血中抗体価に焦点を当てて行う。
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