| Project/Area Number |
22K08740
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
高橋 麻衣子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (50348661)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永山 愛子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (00573396)
塩谷 文章 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, ユニット長 (10627665)
関 朋子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (70528900)
林田 哲 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (80327543)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | 遺伝性乳がん卵巣がん症候群 / HBOC / BRCA / CRSPR-Cas9 |
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| Outline of Research at the Start |
狭義のHBOCはBRCA 1/2の生殖細胞系列の変異に起因するが、変異の場所と状態によってはVUSと判定されることがあり、これに対する臨床的な対応は定まっていない。個々のVUS変異がBRCA 1/2蛋白質の機能異常を生じるか否かを同定できれば、臨床応用可能な定性的診断マーカーとしての活用の道が開ける。我々はBRCA変異に伴う発癌プロセスにおいて、これまでに考えられてきた相同組み換え修復異常ではなく、DNA複製ストレス応答異常がゲノム不安定性獲得に深く関与するという独自の仮説を立てた。このメカニズム解明を通じて、BRCA遺伝子の病的変異を分子生物学的に判定する手法の確立を目的として研究を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
狭義の遺伝性乳癌卵巣癌症候群（HBOC）はBRCA 1/2の生殖細胞系列の変異に起因するが、変異の場所と状態によってはVariants of uncertain significance (VUS)と判定されることがあり、これに対する臨床的な対応は定まっていない。個々のVUS変異がBRCA 1/2蛋白質の機能異常を生じるか否か。また、この機能異常により得られる分子生物学的な現象を同定できれば、臨床応用可能な定性的診断マーカーとしての活用の道が開けると考えられる。ゲノム不安定性の要因としてDNA複製ストレスが近年注目を集めているが、これにより生じる一本鎖DNA切断の頻度は非常に高い。そのため、我々はBRCA変異に伴う発癌プロセスにおいて、これまでに考えられてきた相同組み換え修復異常ではなく、DNA複製ストレス応答異常により、がん発症前であっても「サイレントなゲノム異常の蓄積」がDNA複製ストレス応答異常により生じていることにより、ゲノム不安定性獲得に深く関与するという独自の仮説を立てた。これにyおり、本研究を進めることで、BRCA1/2においてVUSと分類された変異が、本質的に病的変異である場合にはDNA複製ストレス応答異常という表現系を示すことが想定され、これを基にしたVUSのPathogenic/Non-Pathogenic判定、すなわちHBOC症候群診断が可能になると考えた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではまず日本人において最も頻度が高いBRCA２変異を対象として細胞株の樹立および解析を行った。変異を有するヘテロ・ホモ接合の両者の細胞株をCRISPR-Cas9によるゲノム編集技術を用いて確立したところ、これら細胞ではBRCA2 - c.7871A>G (p.Tyr2642Cys)に変異を持ち、これはBRCA遺伝子変異のデータベースであるBRCA ExchangeにおいてVUSと規定されているものであった。現在、ポジティブコントロールとなる病的変異株の樹立を同じ手法を用いて行っており、樹立した複数のクローン株の解析を行って、選定作業を遂行中である。
また、樹立されたVUS株に対して、BRCA２が関与する細胞周期チェックポイント機能試験におけるハイドロキシウレア（HU）を用いた実験の結果からは、HU添加により親株およびヘテロ接合株においては、増大したDNA損傷に対して、RPAやChk1のリン酸化が生じたが、ホモ接合体においてはHU添加した場合のpChk1, pRPAの上昇が乏しく、正常なDNA損傷に対する応答が行われていない事が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の検討として、確立されたBRCA２変異クローンに対し、DNAファイバーアッセイを用いて定常状態における臓器特異的シグナルとしてエストラジオール（女性ホルモン）存在下でDNA複製フォークの進行速度を測定し、DNA複製ストレス度を明確にする。さらに、BRCA2-VUS変異が病的変異クローンと同等のストレス度を示すかどうかについて明らかにする。またBRCA2VUS変異や病的変異保有細胞におけるDNA複製ストレス誘発原因として転写と複製の衝突頻度やその結果生じるR-loop構造の発生頻度などを解析し、ゲノム異常が発生する要因を明らかにする。これに加えて、DNAファイバー法を応用し一時的DNA複製ストレスによるフォーク停止からのフォーク進行再開を指標としてDNA複製ストレス回復能を解析しPathogenic 変異様の性質を示すVUS変異を同定する
これら検討を経て、病的変異と判定されたVUS変異クローンにおける表現系として、RSR異常によって生ずる複製フォークの変化を中心に診断マーカーを探索する。進行中の複製フォーク近傍のタンパク質の質量分析を利用し、RSR関連タンパク質量変化や翻訳後修飾を対象とする。この解析に加えて、BRCA2VUS変異クローン（Pathogenic/Non-Pathogenicを含む）および Pathogenic変異クローン細胞に対して全ゲノム配列解析を含むマルチオミックス解析を行い特徴的なゲノム異常領域、DNAメチル化領域、R-loop発生領域を比較し、BRCA2VUS変異クローンを定性的に診断しうるマーカーを網羅的に探索する。
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