胆道癌におけるChemokineによる悪性度進行機構の解明

• Project/Area Number: 22K08813
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55020:Digestive surgery-related
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 中西 喜嗣 北海道大学, 大学病院, 特任助教 (40447058)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平野 聡 北海道大学, 医学研究院, 教授 (50322813) ; 土川 貴裕 北海道大学, 大学病院, 講師 (50507572) ; 佐々木 勝則 北海道大学, 医学研究院, 学術研究員 (60336394)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: ケモカイン / 胆道癌 / 上皮間葉転換 / 癌関連微小環境

Outline of Research at the Start

本研究は、胆道癌に対して、1）治療ターゲットとなりうるChemokine receptor (CR)、ならびに 2）Biomarker としての血中Chemokineの同定、を目的とする。
・ 胆道癌細胞株のCRの発現亢進を確認し、リガンド刺激による悪性度関連機能変化(浸潤/遊走能など)を明らかにする。
・腫瘍進行へ関与が示唆されたCR陽性胆道癌細胞株を移植したマウスに対するCR抗体投与による腫瘍進展制御能を示す。
・胆道癌臨床検体におけるCR発現強度による臨床病理学的因子ならびにに術後予後との比較、血清中のchemokineを測定し、新規biomarkerとしての候補を示す。

Outline of Annual Research Achievements

１）細胞株使用実験：ケモカインレセプターCXCR7に関して、4種の細胞株 (KKU-100, TFK-1, EGI-1, TYBDC-1) においてPCR, western blotで発現を確認し、CXCR7のリガンドであるCXCL12 を添加したmigration assay, invasion assayにより、CXCR7が発現していた細胞株 (KKU-100, TFK-1, TYBDC-1) の遊走能、浸潤能の上昇を確認した。また、特にCXCR7の発現が強かった一種の細胞株について、CXCR12の中和抗体を添加したmigrationならびにinvasion assayでは、中和抗体を添加した細胞でmigration, invasion がともに抑制されることが判明した。加えて、中和抗体により、当該細胞株において、Rt-qPCRでE-cadherinの発現低下を認めた。
２）病理組織検体使用実験：肝門部領域胆管癌切除検体においてCXCR7染色を行い、染色強度を三段階に群分けしたところ、免疫染色強度が強くなるにつれ、予後が不良であったことも示された。また、臨床病理学低因子としては、CXCR7免疫染色強度が高度である症例は主病巣の深達度が深く、リンパ節転移頻度が高い傾向にあった。
３）遺伝子解析（計画書に記載外の研究）：当科切除標本から摘出された凍結検体約50例にてRNA sequenceを行い、Differential expression gene解析でCXCR7発現によって2群間に分類し、Gene set enrichment analysis解析で腫瘍関連のpathwayを確認したところ、CXCR7強陽性群でepithelial mesenchymal transition pathwayのup-regulationされていたことが判明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定された研究はほぼ順調に行われている。また、計画では予定されていなかった、RNA sequenceのデータも加味され、研究に厚みが増しているとも考えられる。
一方で、マウスを使用した動物実験、患者血清を使用したケモカイン濃度の測定などは、COVID-19感染蔓延などにより、予定が遅れる見通しとなっている。

Strategy for Future Research Activity

RNA sequenceの結果が非常に興味深いことから、さらに50例ほどのsequenceを追加する予定である。
また、マウスによる実験を令和5年度は施行する予定である。
さらには、細胞株の実験にて、特にこちらの予測に合致するものについては、CXCR7のノックダウンを行い、リガンド添加による生物活性の比較を行いたいと考えている。