肝がんの分化規定遺伝子の同定と革新的治療法の開発

• Project/Area Number: 22K08818
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55020:Digestive surgery-related
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 播本 憲史 群馬大学, 医学部附属病院, 准教授 (00419582)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三森 功士 九州大学, 大学病院, 教授 (50322748) ; 横堀 武彦 群馬大学, 未来先端研究機構, 准教授 (60420098) ; 調 憲 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (70264025) ; 伊古田 勇人 群馬大学, 医学部附属病院, 准教授 (90420116) ; 川端 麗香 群馬大学, 未来先端研究機構, 講師 (90721928)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 肝細胞癌 / 分化 / 肝内胆管癌 / 形態病理 / 肝がん

Outline of Research at the Start

従来、癌組織は腫瘍内で均一でなく、heterogeneity（不均一性）を持つと報告され、肝癌の多段階発癌にかかわる遺伝子を描出するのにheterogeneityが障害となっていた。新たに空間的遺伝子発現解析を肝癌に適用することで、肝癌組織切片における全トランスクリプトームを測定し、病理形態的差と遺伝子発現の関係を視覚的に捉えることが可能となる。この新たなツールを用いて肝癌の最も臨床的予後に関与する分化度を規定する遺伝子を同定し、その機能解析を行い、分化度規定遺伝子をコントロールすることで肝癌の分化を誘導し治療へ応用することを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

肝細胞癌切除症例の内、形態的な違いを持ちかつ、分化度が異なるcomponentを持つ切片を19症例、混合型肝癌4症例を病理学伊古田先生とともにピックアップした。ホルマリン固定であるため、このうちRNAのクオリティが十分高いことを検証し、肝細胞癌切除4症例、混合型肝癌4症例の網羅的空間的遺伝子解析を行った。このうちvisiumによる遺伝子発現が著明な肝細胞癌切除３症例、混合型肝癌３症例の病理学的表現型の差（分化度の差）と遺伝子発現の差を網羅的な解析してた。有望な遺伝子を同定しつつある。特に増殖活性の高い部位と脂質代謝にかかわる遺伝子の発現の差が著明であり、予測されるT細胞浸潤のサイクリングに従って、ホットな領域とコールドな領域に分けたところ、HCC領域の代謝がCCC領域の代謝とは異なっていることがはっきりわかった。特に遺伝子Xは、免疫細胞浸潤が豊富な領域 （hot tumor)で高発現し、遺伝子Yは、免疫細胞が乏しいcold tumor領域で高発現していた。HCC切除サンプルでタンパクXの発現と免疫細胞の関係をIHCにて検討したところ、visiumの結果の通り、タンパクXの発現が高く同部位のCD8の浸潤が多く、タンパクＢの発現が少ない症例では免疫細胞の浸潤も少ないことが判明した。またTCGAデータからHCCにおいて遺伝子Xが高発現していると予後不良であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ホルマリン固定のサンプルからRNAクオリティの良いものを描出し実際の空間的遺伝子解析を合計６検体で行うことができた。まず、免疫反応が豊富な領域とそれ以外の領域に分け、HCCとCCCそれぞれで発現の差がある遺伝子を描出した。
予測されるT細胞浸潤のサイクリングに従って、ホットな領域とコールドな領域に分けたところ、HCC領域の代謝がCCC領域の代謝とは異なっていることがはっきりわかった。
特に遺伝子Xは、免疫細胞浸潤が豊富な領域 （hot tumor)で高発現し、遺伝子Yは、免疫細胞が乏しいcold tumor領域で高発現していた。
HCC切除サンプルでタンパクXの発現と免疫細胞の関係をIHCにて検討したところ、visiumの結果の通り、タンパクXの発現が高く同部位のCD8の浸潤が多く、タンパクＢの発現が少ない症例では免疫細胞の浸潤も少ないことが判明した。
さらにTCGAデータからHCCにおいて遺伝子Xが高発現していると予後不良であった。
以上のことが示され今年度の検討結果からは、visumで同定された遺伝子XはHCCとCCCの両者でcold tumorの形成に寄与することが明らかとなった。HCCもCCCもcombined HCCのすべてをhot tumor化する治療標的として有望、つまりICIとの併用も有望である可能性がある。

Strategy for Future Research Activity

最終年度であり、invivoの検討は難しいとかんがえる。このため、
遺伝子Xは脂質代謝に関連する酵素であるため、脂質関連のメタボロームを行い、遺伝子Xのタンパクレベルで脂質関連酵素PGEsの発現と免疫細胞（CD3,4,8,CD163）の関連と発現クラスタリングを行う。CD8 (FASTREDII)とGPX2 (DAB)の２重染色で関連評価 （HCCとCCCとcombinedHCC)遺伝子Xの高発現領域で特徴的なtumor microenvironment関連分子の変動をリスト化する。
HCC臨床検体10例における遺伝子X高発現部と低発現部のmicrodissectionを行い遺伝子変異解析を行う。さらにGDC/ICGC data portalやSRAに登録されている肝癌・肝内胆管癌のRNA-seqあるいはscRNAseqデータ、変異データ、臨床情報を入手し、候補因子の発現と分化度や予後との関連解析を行う。
以上により、遺伝子Xの免疫との関連を検討する。