KLF5を基軸とした新たな癌関連分子制御メカニズムの解明

• Project/Area Number: 22K08847
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55020:Digestive surgery-related
• Research Institution: Sapporo Medical University (2023); Osaka University (2022)
• Principal Investigator: 三代 雅明 札幌医科大学, 医学部, 助教 (70645077)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 浩文 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30322184) ; 横山 雄起 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60615714)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: KLF5 / 消化器癌

Outline of Research at the Start

KLF5 (Kruppel-like factor 5) は大腸癌や食道癌といった特定の癌種でのみ発現が亢進している転写因子であり、治療標的として有望である。KLF5が活性化する下流の遺伝子群には複数の重要な癌関連遺伝子が存在し、私たちはこれまでの研究で、KLF5の新たな標的遺伝子候補としていくつかの癌関連分子を同定している。そこで本研究では、細胞株や臨床サンプルを用いた検討を行うことで、KLF5を基軸とした新たな癌関連分子制御メカニズムを明らかにし、新規治療法の開発につなげることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

KLF5 (Kruppel-like factor 5) は消化器腺癌や扁平上皮癌といった特定の癌種でのみ発現が亢進している転写因子であり、大腸癌においては発癌に重要な癌幹細胞マーカーとしての報告もあり、治療標的として有望である。本研究では、KLF5を基軸とした新たな癌関連分子制御メカニズムを明らかにし、新規治療法の開発につなげることを目指す。初年度の研究では、in silico解析の結果からKLF5の新たな標的遺伝子と考えられる候補のうち、これまで教室で研究してきたMUC1およびPD-L1遺伝子に着目し、KLF5が両遺伝子の発現調節にどのように関わっているかについて検討を行った。その結果、siRNAによるKLF5ノックダウンによって、MUC1, PD-L1発現はいずれも低下し、プロモーターアッセイの結果、MUC1, PD-L1のプロモーター活性はKLF5阻害剤の投与によって、有意に抑制された。今年度はChromatin immunoprecipitation (ChIP) 実験を行い、KLF5タンパクが実際にMUC1, PD-L1プロモーター領域に結合していることを明らかにできた。MUC1プロモーターに相当するフルサイズ [-1000～転写開始点～+200] のレポータープラスミドを作成したがMUC1の転写活性化は得られず、[-1000～転写開始点～+30] の領域を含んだレポーターを作成したところ強い転写活性が得られた。この領域を短縮化した複数のレポーター（-1000を-620, -590, -530, -500, -415, -265, -115に短縮）を作成して転写結合部位の同定を試みていたが、米国の研究グループより同様の実験によって、-539～-533が重要との報告があったため、この実験はここまでに留めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度はChIP-qPCR実験の結果、KLF5タンパクが実際にMUC1, PD-L1遺伝子のプロモーター領域に結合していることを明らかにできた。MUC1についてはKLF5のプロモーター結合部位は他のグループにより報告されたが、PD-L1についての報告は未だなく、今後明らかとしてゆく。

Strategy for Future Research Activity

PD-L1プロモーター全長と長さを削った複数のコンストラクトを作成し、KLF5の結合部位を同定する。臨床サンプルを用いた免疫染色の準備も進めており、KLF5、PD-L1の抗体の選定や染色条件の決定もできている。今後、連続切片を作製し、両者の発現パターンを比較検討する予定である。