| Project/Area Number |
22K08898
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55020:Digestive surgery-related
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
宮尾 晋太朗 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (00833708)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
巽 孝成 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (70896711)
辻本 成範 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (80896712)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | FFPE / RNA-seq / single cell RNA sequence |
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| Outline of Research at the Start |
がん研究はSingle cell RNA sequenceの魅力的な分野の一つであり, 予後向上や予後予測, 正確な標的治療が可能と考えられている. ホルマリン固定は世界中で使用されている組織固定法であるが, 固定標本から高品質のRNAを抽出することは困難で, 微量標本に対する解析の大きな障害である. これを克服することで, 世界中で保管された組織から遡及的研究が可能となり, 真の個別化医療への道が拓けると考えた.
今回従来のSC3-seq法を改変し, FFPE標本から次世代シークエンサー解析の為のLibraryが作成可能な精度での革新的cDNA合成法の確立を目的とする.
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウスES培養細胞をホルマリン固定した細胞に対する定量性の高いcDNA合成法の確立
予備実験と同様に「2i+LIF」条件下で培養した, より均一性の高いES細胞集団を標準試料として使用し, 仮説として挙げた方法論の条件検討を行う. 単離したES細胞をホルマリン液に浮遊させて固定を行い, 遠心し洗浄する. 実体顕微鏡で観察下に1-10細胞程の微少量を採取し, cDNA合成を行う. また同一の細胞集団から未固定の細胞も採取し, cDNA合成を行う. 代表的な遺伝子群の発現レベルをqPCRで比較し, ホルマリン固定された細胞において生細胞に近いレベルでの合成効率を目標とする. この行程においてはSC3-seq法に加える試薬の影響や, 温度条件によって生じる可能性のあるRNA分解に留意しつつ, cDNA合成を最適化する.
予備実験段階では24時間ホルマリン固定を行った細胞に対しては, タンパク分解酵素を加えることでcDNA合成効率は改善は認めたが, さらに精度の向上を目指し, 条件検討を追加で行う. その他より効率的に細胞溶解するために, detergentの検討やその他試薬の条件検討を行い, ES細胞のホルマリン固定という最も安定的な条件における, 手法のbrushupを行った.
その結果, 現在使用していたSC3-seq法ではない手法に対してタンパク分解酵素の行程を加えるとどうなるかを検証した.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予備実験の検証は再現性が確認され順調と考える. しかし温度条件やホルマリン処理時間の調整だけでは効率改善の限界がある可能性も示唆された. そのため使用に慣れていたSC3-seq法以外へのタンパク分解酵素処理の導入を検証する必要があると考えた.
まずは候補となる方法論がしっかりとworkすることを確認する必要があるため, 結果として実験計画からは若干の遅れが生じていると考える.
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| Strategy for Future Research Activity |
より適切な方法論を決定し, 現在確率した温度条件やホルマリン処理時間を導入することで結果が改善するかを検証する. より適切な方法が決定すれば, 当初の実験計画どおり生体内の組織から作成したFFPE標本において使用可能かを検討する. 具体的にはマウスの肝臓を採取し, ホルマリン固定の有無でどの程度の効率でcDNA合成が可能かを検討する. その際により実臨床検体に近づけるため, FFPE標本を作成後にレーザーマイクロダイセクションシステムを用いて、微少量の細胞を採取して cDNA 増幅を行い, 条件検討を行う.
FFPE標本での条件設定が完了すれば, 実臨床の検体を用いた研究へと発展させる予定である. 具体的には食道疾患の生検組織・手術標本を観察し, 微小領域を採取して検討することで, 先の知見で得られた遺伝子変異の蓄積を評価し, 治療・予後データとリンクさせる. そのような遡及的研究を行うことでより正確な治療標的や治療マーカー, 前癌病変となるような異形成の予測因子などの検索が可能になると考える. 候補遺伝子が見つかれば機能解析を行う.
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