オルガノイドを用いたメチル基転移酵素による肝内胆管癌リンパ節転移の機序解明

• Project/Area Number: 22K08900
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55020:Digestive surgery-related
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 速水 晋也 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (00468290)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上野 昌樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (90405465) ; 宮本 篤 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00756570) ; 山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 学長特命教員(特別顧問) (20191190)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 肝内胆管癌 / SMYD2 / リンパ節転移 / CRISPR/Cas9 / メチル化 / オルガノイド / メチル基転移酵素

Outline of Research at the Start

肝内胆管癌は予後不良であり、リンパ節転移は強い予後不良因子だが、診断に用いられている現代のモダリティでは限界がある。本研究では第一に、肝内胆管癌転移リンパ節で高発現していたメチル化酵素SMYD2（SET and MYND domain containing 2）による転移メカニズムを、胆管癌オルガノイドを用いて明らかにする。第二にSMYD2をターゲットとしてcirculating cell-free tumor DNA（ctDNA）の発現をモニタリングし、肝内胆管癌リンパ節転移の非侵襲的検査方法を開発する。これにより、適切な手術適応決定・術前/術後化学療法の最適な使用につながる。

Outline of Annual Research Achievements

①オルガノイドにおけるSMYD2抑制系として、CRISPR/Cas9遺伝子改変技術を使用した。Manufacturers’ protocolに則り、Lipofectamine 3000によるリポフェクタミン法でSMYD2 CRISPRプラスミド(h)を導入した。免疫化学染色にてSMYD2の蛍光低下ないし消失を確認し、本実験系の構築が成立した。
② SMYD2阻害剤LLY-507を用いて臨床実装に近いSMYD2抑制実験を行った。まず実験系におけるLLY-507の指摘濃度を決定した。LLY-507を決定した適性濃度で処置し、免疫化学染色で確認する。
③確立したSMYD2抑制系を用いて、EMT関連タンパク抗体を用いた免疫化学染色を行い、SMYD2抑制によってどの分子の変動があるか、つまりSMYD2の下流に存在する分子の検討を以下の抗体で行った：TGF-β1/VEGFC/N-cadherin/E-cadherin/β-actin。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、研究が進んでいるため。

Strategy for Future Research Activity

当初予定した通り実験計画を進める。