再生医療における他家積層線維芽細胞シートの新たな緩慢凍結保存法の開発

• Project/Area Number: 22K08937
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55030:Cardiovascular surgery-related
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 白澤 文吾 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (80444719)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 亮 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (10570319) ; 上野 耕司 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (30736070) ; 濱野 公一 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60263787) ; 溝口 高弘 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (90844796)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 細胞シート移植 / 再生医療 / 細胞シート

Outline of Research at the Start

細胞シートは様々な疾患に応用する研究が行われているが、臨床応用を考えたときに、細胞シートの製造コストと利便性の向上が課題である。
我々は細胞シートを凍結保存することが可能であれば、製造コストの低下、利便性が向上すると考え、これまで細胞シート凍結法の開発を行ってきた。
最近、我々は3Dフリーザーという凍結装置で細胞シートを凍結すると、解凍後の細胞の生存率が高いことを報告している。
本研究は、3Dフリーザーで凍結し、解凍後の細胞シートを動物モデルに移植することで有用性を証明するものである。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、マウス尾からの単離した線維芽細胞シートの樹立およびその線維芽細胞シートの凍結保存の検討を行った。
C57BL/6マウスおよびC3H/HEマウスの尾から線維芽細胞を単離し、線維芽細胞シートを作製した。
線維芽細胞シートを凍結保存する細胞保存液を検討するために、DMSOを含有している細胞保存液、DMSOを含有していない細胞保存液を使用して、線維芽細胞シートを3Dフリーザーで凍結後に、-80℃で保存し、その後、解凍して培養した時の細胞生存率を細胞代謝試薬で評価した。コントロールとして、非凍結の線維芽細胞シートの細胞生存率を100%としたところ、DMSOを含有している細胞保存液で凍結したC57BL/6マウスおよびC3H/HEマウスの線維芽細胞シートの細胞生存率は約80%前後であったが、DMSOを含有していない細胞保存液で凍結したC57BL/6マウスおよびC3H/HEマウスの線維芽細胞シートの細胞生存率は約25-60%前後であったことから、本研究では、細胞保存液はDMSO含有を使用することにした。
非凍結線維芽細胞シートおよび3Dフリーザーで凍結保存した線維芽細胞シートを解凍して培養した時に、線維芽細胞シートが分泌する成長因子をELISAで解析したところ、非凍結線維芽細胞シートの分泌能を100%とすると、凍結保存した線維芽細胞シートのVEGF、HGF、SDF-1の分泌能は、約60-80%であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウス線維芽細胞シートの凍結条件を決めることが出来た。また、凍結解凍後のマウス線維芽細胞シートの細胞生存率および成長因子の分泌能を確認することが出来たため。

Strategy for Future Research Activity

マウス皮膚潰瘍モデルに対して、自家線維芽細胞シートおよび他家線維芽細胞シートを非凍結および凍結保存したものを移植することで、その治療効果を検証する。

Research Products

• [Journal Article] Cryopreserved allogenic fibroblast sheets:development of a promising treatment for refractory skin ulcers (2022)
  • Author(s): Soichi Ike, Koji Ueno, Masashi Yanagihara, Takahiro Mizoguchi, Takasuke Harada, Kotaro Suehiro, Hiroshi Kurazumi, Ryo Suzuki, Tomoko Kondo, Tomoaki Murata, Bungo Shirasawa, Noriyasu Morikage, Kimikazu Hamano
  • Journal Title: American Journal of Translational Research Volume: 14 Pages: 3879-3892
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 3Dフリーザーによる細胞シート凍結の可能性 (2022)
  • Author(s): 鈴木亮、上野耕司、池創一、山本直宗、松野祐太朗、藏澄宏之、桂春作、白澤文吾、濱野公一
  • Organizer: 第21回日本再生医療学会