全身麻酔薬の腕傍核における侵害情報伝達への作用の解明

• Project/Area Number: 22K09064
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55050:Anesthesiology-related
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 山本 純偉 筑波大学, 医学医療系, 講師 (50402376)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: 腕傍核 / 麻酔薬 / カルシウムイメージング / CGRP / 全身麻酔薬 / 侵害情報伝達 / 光遺伝学

Outline of Research at the Start

全身麻酔薬は脊髄・脳幹・大脳など中枢神経系に作用し、鎮痛をもたらすと考えられているが、全身麻酔薬が脳のどこで、どのように作用し鎮痛作用を生み出しているのかはよく分かっていない。近年、神経科学研究の進歩により、その侵害情報伝達経路として、脊髄―腕傍核―扁桃体経路が重要であることが分かってきた。しかし、全身麻酔薬がこの経路にどのように作用し、侵害情報を変化させているのかはほとんど分かっていない。本研究は、カルシウムイメージング法とパッチクランプ法を用いて、全身麻酔薬とその鎮痛補助に最も頻用されるオピオイドが、腕傍核にどのように作用し、扁桃体への侵害情報伝達を変化させるかを明らかにすることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

近年、侵害情報の伝達経路として脊髄-腕傍核-扁桃体中心核が重要であることがわかってきた。脊髄の上行性侵害受容ニューロンの多くは橋にある腕傍核に投射し、腕傍核に入った侵害受容情報のほとんどが扁桃体中心核や視床下部に投射することが示されている。特に外側腕傍核から扁桃体中心核へ投射する神経細胞のほとんどがCGRP陽性であることから、CGRPCreマウスにAAV5.Syn.GCaMP6fとAAV5.hSyn.DIO-mCherryを注入し、右外側腕傍核における侵害刺激の伝達に重要なハブである腕傍核に対する麻酔薬の作用を調べることを目的として実験を行った。
ウイルス投与したCGRPCreマウスの急性脳スライスを作成し、GCaMP陽性の外側腕傍核ニューロンの多くがCGRP陽性であることを確認した。
次に、CaMP6fが適切に反応するかを確認するために、50 mMの高濃度KClを灌流投与して神経細胞を脱分極させたところ、GCaMP6fによるカルシウム応答が確認できた。薬剤の影響を調べるためには一定の刺激が繰り返し必要であるため、近くの腕傍核をバイポーラ電極で電気刺激することにした。電極の位置は既存の文献を参考に決定したが、カルシウム応答が得られなかったり反応が弱かったため、神経細胞が脱分極しやすくなるようゼロマグネシウムの灌流液で10分間灌流した後に電気刺激を行い、比較的安定した反応が得られた。そのため、その後の観察では、ゼロマグネシウムの灌流液で10分間灌流した後に電気刺激を行い、応答を観察した。まず、灌流投与しやすいベンゾジアゼピン系静脈麻酔薬であるミダゾラムとμオピオイド受容体作動薬のDAMGOを灌流投与し、応答の変化を調べた。肉眼的には反応の変化はあまり見られなかったが、現在、記録した画像をImageJ Fijiで解析中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度は安定した刺激を得ることができませんでしたが、今年度はゼロマグネシウムの灌流液を使用することで電気刺激による応答が得られるようになりました。本研究の目的は、外側腕傍核のカルシウムイメージングを通じて麻酔薬が外側腕傍核に及ぼす影響を明らかにすることです。今年度、ベンゾジアゼピン系静脈麻酔薬のミダゾラムと、外側腕傍核に多く発現していると報告されているμオピオイド受容体作動薬のDAMGOの投与による変化の記録が取れました。
また、今まで、ペリスタットを使用して灌流速度を一定にすることで、薬剤の投与による反応をより厳密に特定しようとしていましたが、外側腕傍核はスライスの端に位置することから、グリットの位置を工夫していてもペリスタットの回転による速度の変化でスライスが動き、安定した記録が取れない、ノイズが生じる等の問題が生じていました。点滴センサーのIDC-1501を用いて自然落下により、速度の変化を最小にするとともに速度を一定に保つことが可能となり、この問題を解決することができました。
ただし、現在、記録したデータをImageJ Fijiを用いて解析しようとしていますが、画像の経時的変化の定量化がうまくいかず、今回は結果を提示できません。しかし、他大学のイメージングを行っている研究者の協力を得て解析を進める予定です。また、GCaMPとDIO-mCherryを注入したCGRP-Creマウスもすでに作成してあり、データ解析とともに他の麻酔薬の影響も調べる予定です。

Strategy for Future Research Activity

既に収集したミダゾラムとDAMGOのデータの解析を進めるとともに、データの数が少ないこと、また雌雄のデータも取得したいと考えているため、まずはミダゾラムとDAMGOの追加データを記録することを計画しています。また、他の麻酔薬としてプロポフォールや、現在研究室で他の研究者が行動実験に使用している慢性痛の治療薬であるミロガバリンについてもデータを取る予定です。
膜電位が低下すると蛍光強度が上がるタイプの新しい膜電位感受性色素が販売されており、自分が調べたい麻酔薬の作用を見るには、カルシウムインジケーターよりも適していると考えられます。そこで、これを使って実験を行いたいと考えていましたが、新しい膜電位感受性色素は現在プラスミドでのみ販売されており、AAVへのパッケージングが必要です。昨年、パッケージングの見積もりを3社に依頼しましたが、いずれも100万円近い金額だったため断念しました。
もしパッケージングされた製品が販売されれば、費用が低くなると考えられるため、定期的にチェックし、販売され次第、購入して実験を行いたいと考えています。