播種性血管内凝固症候群の血小板減少に関与するmicroRNAと標的遺伝子の同定

• Project/Area Number: 22K09198
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55060:Emergency medicine-related
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 影山 京子 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (80347468)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹下 淳 関西医科大学, 医学部, 研究医員 (40433263) ; 中嶋 康文 近畿大学, 医学部, 教授 (70326239)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
• Keywords: microRNA / Pyroptosis / 遺伝子治療

Outline of Research at the Start

（臨床研究）感染症とSOFAスコア２点以上上昇のある敗血症患者で、急性期DICスコアの血小板数１点以上の血小板数減少群、０点の血小板数維持群、非敗血症患者群との3群比較で、血小板内miRNA発現の差異を検出する。同時にmRNAの発現解析を施行することで、パスウェイ解析ソフトウェア を用いてmiRNA-mRNAの相互作用を解析し、血小板減少の要因となる遺伝子、蛋白質を予測する。
（細胞実験）血小板系培養細胞（Meg-01）細胞を用いて臨床研究から推定された血小板数減少に関連するmiRNA、ｍRNA、タンパク質を同定する。

Outline of Annual Research Achievements

患者予後と関連する敗血症時の血小板数減少の原因として、過度の血小板活性化と、引き続き起こる血小板細胞死の現象が関与すると考えている。その機序と新しい予防法・治療法を見出すために、健康成人から採取した血液を用いて細胞培養実験により、次世代シーケンサーを用いた血小板内と、血漿中の網羅的なmicroRNA（miRNA）発現解析を行った。今後は臨床研究により、より詳細にその病態解析を展開したい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

健康成人の被験者の末梢静脈から、1回２０ｍｌの採血を行った細胞培養系の以下の実験系で、予想通りの結果が得たので。
a. miRNAの分離と濃縮　クエン酸採血後、遠心操作にて多血小板血漿作成後、洗浄血小板溶液の作成。血小板内miRNA変化を観察する目的で、敗血症病態の主因となるリポ多糖体、ヒストン、HMGB1等の DAMPs投与前後の洗浄血小板検体から、mirVanaTM miRNA Isolation Kit 等を用いてmiRNAを抽出する。
b. 包括的miRNAの発現プロファイリング　次に、定量性のある網羅的miRNAプロファイリングを、従来のマイクロアレイより優れた次世代高速シーケンサーIon PGMシステム (Life Technology社) を用いて絶対的な定量法を施行。
統計学的な有意差検定を伴う発現定量解析には、CLCバイオ社の解析ソフト（Genomic Work Bench）を使用する。
上記の発現定量結果から、特に血小板内でmiRNAが変化したmiRNAを選別する。
選別されたmiRNAのターゲットとなるmRNAを複数のmiRNA Prediction Tool (Miranda, TargetScan Human5.0, PicTar, miRBase Targets Version 5.0)等で探索する。特に細胞死・炎症病態に関連するmRNAに相補配列のあるmiRNAを選別する。

Strategy for Future Research Activity

（臨床研究）
敗血症患者の末梢血から洗浄血小板溶液を作成し細胞培養系（In Vitro）で有意に変化のあったmiRNAの発現、mRNAの発現（ターゲット遺伝子）、タンパク質発現を、臨床研究で、患者から採血した検体を用いて、リアルタイムPCR法、およびウエスタンブロット法で解析する。