Project/Area Number |
22K09237
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 56010:Neurosurgery-related
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Research Institution | University of Miyazaki |
Principal Investigator |
水口 麻子 宮崎大学, 安全衛生保健センター, 講師 (00647472)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横上 聖貴 宮崎大学, 医学部, 准教授 (40284856)
山下 真治 宮崎大学, 医学部, 助教 (40468046)
渡邉 孝 宮崎大学, 医学部, 講師 (90573337)
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Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2026: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
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Keywords | EVI1 / PDGFRb / 血管新生 / TKR / 受容体型チロシンキナーゼ / 悪性神経膠腫 |
Outline of Research at the Start |
脳神経外科で保有するグリオブラストーマ培養細胞株を用いて、PDGFRβの発現量を評価し、以降の実験に適した細胞株を選定する。次に、複数のグリオブラストーマ培養細胞株を用いてEVI1の発現変動を行い、PDGFRβおよびその下流に存在する分子、血管新生における主要分子について、発現量の変化を解析する。さらに、PDGFRβのプロモーターアッセイを行い、EVI1によるPDGFRβの発現制御において必須の領域を同定する。また、グリオブラストーマの組織切片からレーザーマイクロダイセクション法を用いて微小血管増殖部分を切り出し、EVI1のmRNA発現量について同一腫瘍の他の部位と比較する。
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Outline of Annual Research Achievements |
①グリオブラストーマ培養細胞株(A172、KS1、LN18、LN229、T98G、U87MG、U251MG、YKG1)を用いて、それぞれの培養細胞を同一条件で培養し、継代して96時間後に回収を行った。その後、それぞれの培養細胞からmRNAを抽出してcDNAを作成し、リアルタイムPCR によりEVI1、EGFR、PDGFRb、VEGFR1、VEGFR2、Notch1、AGGF1のmRNA量を比較した。この実験結果を参考に、②以降の実験で用いる培養細胞株を選定した。
②複数のグリオブラストーマ培養細胞株に対し、継代後2日目(コンフルエンシーは約3-4割)にリポフェクション法によりsiRNAのトランスフェクションを行い、EVI1をノックダウンした。この時、実験の精度をあげるため、siRNA試薬は2種類(ニッポンジーン社製およびThermosientific社製)使用した。トランスフェクション後は約6時間で培地交換を行い、さらに72時間の培養を行った後に細胞を回収し、PDGFRb、VEGFR1の発現変動解析を実施した。この実験結果から、EVI1のノックダウンに伴い、PDGFRbおよびVEGFR1のmRNAおよびprotein発現量が低下する傾向を示す事を確認した。
③PEGFRbおよびVEGFR1のプロモーター領域を組み込んだプロモーターベクターを新たに作成した。既に所属研究室で保有していたEVI1強制発現ベクターと共に、グリオブラストーマ培養細胞株にコトランスフェクションし、48~72時間後に細胞回収した後、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験結果では、EVI1の強制発現に伴いPDGFRbおよびVEGFR1のプロモーター活性の上昇を認めた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナ感染症に対する対応で多忙であった事、また、県外移動の規制もあり、学会発表による報告は行っていない。
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Strategy for Future Research Activity |
今年度の実験結果から、EVI1はPDGFRbおよびVEGFR1に対し、正の遺伝子発現制御を行っていると推測している。一方、EVI1の発現上昇に伴い、これらの遺伝子発現が増加するかどうかについては未確認であり、この課題に沿って実験を推進する。EVI1の強制発現用ベクターは保有しているが、このベクターによる強制発現では、EVI1のmRNAは数万倍にまで発現上昇をきたす。生体内では、悪性神経膠腫患者において、このようなEVI1の極端な発現上昇が起きているとは考え難い。そのため、もっと生理的な条件に近い環境で、EVI1の発現上昇が起きる条件について検討中である。
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