Characterization of mesenchymal stem cell niche in the knee joint

• Project/Area Number: 22K09326
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 古賀 英之 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (30594080)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 辻 邦和 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 特任教授 (20323694) ; 宮武 和正 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (00777435) ; 中川 裕介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (60822666) ; 中村 智祐 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (90725201)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 間葉系幹細胞 / CD44 / 滑膜 / 微小環境 / mesenchymal stem cell / niche / knee oint / synovium / reversibility

Outline of Research at the Start

膝関節組織において、間葉系幹細胞(MSC)は関節組織の恒常性や損傷後修復に必要不可欠であり、その機能破綻は変形性膝関節症(膝OA)に代表される組織退行変性疾患の根本的な原因になると考えられる。本研究では、膝関節においてMSCの微小環境がどの様に維持されているか、また、MSCの可逆性、可塑性の分子機序の解析を行い、膝OAの病態を理解する上で有意義な知見を得ることを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

間葉系幹細胞(MSC)は、成体に存在する組織幹細胞である。膝関節において、MSCは滑膜に存在すると報告されているが、私たちは、CD44抗原陽性の滑膜線維芽細胞(SyF; Synovial fibroblasts)がin vitroで非常に高い可逆性、可塑性を有しており、培養することでMSCの特徴を有する細胞集団を形成することを明らかとした。多種類の細胞から構成される膝関節組織において、MSCは軟骨損傷後の修復等、関節組織の恒常性に必要不可欠であり、その機能破綻は変形性膝関節症(膝OA)に代表される組織退行変性疾患の根本的な原因になると考えられる。そこで本研究では、SyF及びMSCの可逆性、可塑性の分子機序の解析を行い、膝OAの病態を理解する上で有意義な知見を得ることを目標としている。
これまでに、in vitro解析の成果として、CD44のリガンドであるヒアルロン酸が培養条件下においてCD105陽性細胞の分画の維持に非常に重要な機能を果たしていることを証明した。すなわち、培養系からヒアルロン酸を除去した場合、MSC陽性抗原を発現する細胞分画の減少が観察された。また、この反応は可逆的であり、培地中にヒアルロン酸を添加してCD44シグナルを活性化することによってCD105陽性細胞数は増加することを示した。さらにSiRNAを用いてCD44をノックダウンするとCD105のmRNA量が減少することを示した。これらの結果から、CD44を介するシグナルがCD105抗原の発現制御に深く関与することを示した。In vivo実験の成果として、実験計画書に記載したCD44コンディショナルノックアウトマウスの作成を行った。現在マウスの表現型の解析を行なっている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究計画書に記載した、in vivo並びにin vitroの実験双方に進捗が見られたことから、上記の判断とした。

Strategy for Future Research Activity

CD44陽性滑膜線維芽細胞からMSC分画が選択的に形成される分子機序の解析(in vitro解析): これまでの結果から、滑膜線維芽細胞の培養系においてMSCの表現形質を有する細胞が形成される過程で、CD44のシグナル伝達が非常に重要であることが予想された。この仮説を検証し、さらにCD44情報伝達経路の活性化により、滑膜線維芽細胞内でどの様な遺伝発現の変化が誘導されることでMSC分画が形成されるかを明らかとするために、CD44のリガンドであるヒアルロン酸が、in vitroにおいてMSC分画の維持に及ぼす影響の検証を行う。さらに膝滑膜より分離した滑膜線維芽細胞をCD44の発現の有無、発現量の多寡によりFACSを用いてsingle cell sortingを行い、それぞれの分画からMSCが形成される過程を経時的にFlowcytometerを用いて解析を行う。
滑膜特異的CD44欠損マウスにおける膝関節の表現型の変化の解析(in vivo解析)：膝滑膜組織におけるMSC微小環境の維持、関節損傷後の修復過程におけるMSCの活性化のプロセスに、CD44を介する情報伝達経路がどのような生理的意義を有するかの検証を行うためにCD44欠損マウスの表現型解析を行う。本マウスでは滑膜組織特異的にCD44を欠損させるだけでなく、CD44がノックアウトされた細胞がtdTomatoを発現する様にデザインされている。このマウスの加齢に伴う膝関節症変化を組織学的に解析する。また、外傷性OAモデルである前十字靭帯切離 (ACL-T)、内側半月板不安定化 (DMM)を作成し、関節内MSC動態の変化と関節軟骨の退行変性の重症度を組織学的に観察する。以上の実験の結果から、生後の滑膜MSC微小環境の維持におけるCD44の生理機能の考察を行う。