タンパク分解酵素の活性化因子に着目した変形性関節症における軟骨の変性機序の検討

• Project/Area Number: 22K09344
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Clinical Research Center for Allergy and Rheumatology, National Hospital Organization, Sagamihara National Hospital
• Principal Investigator: 岩澤 三康 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 診療部・整形外科, 部長 (60574093)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福井 尚志 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), 外科系リウマチ研究室, 客員研究員 (10251258) ; 津野 宏隆 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), リウマチ性疾患研究部, 医長 (90792135)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 変形性関節症 / MMP / 軟骨変性 / プラスミン / 変形性膝関節症 / 軟骨 / 膝関節 / 関節 / 膝 / タンパク分解酵素

Outline of Research at the Start

変形性関節症（OA）は緩徐に進む関節軟骨の変性消失を本態とする疾患である。軟骨の変性消失は軟骨細胞自身が産生するタンパク分解酵素の作用によるとされ、その発現に関する研究も多いが、酵素の活性化についてはほとんど検討が行われていない。我々はタンパク分解酵素の活性化に関わる因子の検討を行う中で、OA軟骨変性部の軟骨変性にはプラスミンが関与する可能性を見出している。本研究はこの可能性を検証するとともに、OA軟骨変性部においてプラスミンの活性が誘導される機序の詳細を明らかにすることを目的として行われる。本研究の結果から、OAにおける軟骨変性の機序について、新たな知見がもたらされることが期待される。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は変形性関節症（OA）において、関節軟骨の変性消失が生じる機序の詳細を明らかにすることを目的に行われる。OAの軟骨変性については一般に軟骨細胞自身が産生する種々のタンパク分解酵素の作用により生じると考えられており、とくにMMP-1、3、13やADAMTS-4、5といった酵素について、その発現や発現機序に関して今までに多くの研究がなされてきた。しかしこれらのタンパク分解酵素は、そのほとんどがはじめ活性を持たない潜在型として産生され、プロぺプチド領域が切断されて活性型となることで初めて酵素活性を示すようになる。このためこれらのタンパク分解酵素が実際に軟骨基質を分解するには、酵素が産生されただけでなく、さらに活性化される必要がある。しかしながらOAの軟骨変性の過程でこれらの酵素の活性化がどのような機序によって生じるのか、さらに活性化はどのように制御されているのかについては、ごく限られた知見しか得られていなかった。このため本研究ではタンパク分解酵素の活性化に着目して軟骨の変性消失の機序について探索を行った。
研究代表者らは本研究開始に先立ってOA軟骨から採取されたRNAを用いて遺伝子の網羅的な発現解析を行い、OA軟骨の変性部ではウロキナーゼ（uPA）と組織型プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）という2種のプラスミノーゲン・アクチベーターの発現がともに亢進していることを見出した。さらにこの結果に基づいてOA軟骨からタンパクを抽出して予備的検討を行い、OA軟骨変性部では実際に非変性部に比してプラスミンの活性が大幅に上昇している可能性を見出した。プラスミンは種々のMMPの活性化を引き起こす作用があり、その作用によって軟骨の変性消失を引き起こしうる。このため本研究では、軟骨変性部においてプラスミン活性が上昇する機序の詳細の解明を目指した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究初年度の2022年は新たに16例の末期OA膝関節において軟骨の肉眼的な非変性部と変性部から軟骨組織を採取し、それらからタンパク抽出液を調整してその解析を行った。その結果、軟骨変性部からは非変性部に比して明らかに多量のプラスミンが抽出され、また変性部からの抽出タンパクでは非変性部に比してtPA、uPAの活性がいずれも高いことを見出した。しかしtPAの活性はuPAより明らかに高く、さらにtPAの活性は、軟骨変性部からの抽出液においてプラスミン活性との間に有意の正の相関関係が認められた。同じ検体を用いたLuminexによる計測では、軟骨変性部からの抽出タンパクには非変性部に比してtPA、uPA、PAI-1、uPARがいずれも有意に多量に含まれていたが、抽出量は酵素活性の強さと同様にuPAに比してtPAの方が明らかに多いことも確認された。研究初年度にこのように線溶現象に関わる因子の解析が比較的順調に進んだことから、本年度は同じタンパク抽出液についてMMPの活性を検討した。まず初めにMMP-1の酵素活性を計測したところ、その活性は予想通り軟骨非変性部に比して軟骨変性部からの抽出液において有意に高く、さらに変性部からの抽出タンパクにおいてMMP-1の酵素活性と前年度計測したプラスミン活性との間に有意の正の相関関係も認められた。この結果は軟骨変性部においてプラスミンがMMPの活性化を誘導して軟骨変性を進めるという代表者らの仮説と一致するものである。しかし一方、同じタンパク抽出液を用いた計測では、MMP-1とともにOAの関節液中に多量に存在するMMP-2、3については軟骨変性部、非変性部とも酵素活性がほとんど検出されないという結果となった。軟骨変性部においてプラスミン活性が亢進しているにもかかわらずこれらの活性が亢進していない理由は現段階では不明で、その解明は次年度の課題と考えられた。

Strategy for Future Research Activity

研究最終年度となる2024年度には以下の2つの課題について解明を進める。課題の第一はOA軟骨変性部においてtPA、uPAの発現が亢進する機序の解明である。代表者らは本研究を開始する以前に、軟骨細胞が周囲のマトリクスの変化に応じてuPA、tPAを発現するようになることを見出している。ヒト関節軟骨細胞には複数のインテグリンが発現しており、インテグリンからの細胞内シグナルによって軟骨細胞の挙動が大きく影響されることが知られている。これらの知見から、代表者らは現在、uPA、tPAの発現が特定のインテグリンの活性化によるのではないかと考えており、2024年度にはまずこの可能性について検討を行う。この検討はアルジネートビーズを用いて三次元培養された軟骨細胞を用いて行う予定で、三次元培養された細胞に軟骨細胞において発現することが知られているインテグリンヘテロダイマーに対する種々のリガンドを加えてuPA、tPAの発現の変化を調べることによってどのヘテロダイマーがそれらの発現に関与するのかをまず明らかにする。
2024年度に解明を目指す課題の第二は、軟骨変性部におけるMMPの間の活性化の差がなぜ生じたのかを明らかにすることである。前項で述べたように代表者らは軟骨変性部においてMMP-1の活性は亢進しているが、同じ検体で計測したMMP-2、3の活性は変性部、非変性部とも非常に低いという結果を得た。MMP-1の活性化はプラスミンの作用によると考えられるが、なぜ他のMMPの活性が同時に誘導されないのかについて検討を行う。MMP間の活性の差については現在、プラスミンによる活性率が異なる可能性、TIMPやα2-macroglobulinによる抑制効率が異なる可能性の2つの可能性を考えており、まずこの2つの可能性について検討を行う。

Research Products

• [Journal Article] Analysis of proteins released from osteoarthritic cartilage by compressive loading (2023)
  • Author(s): Tsuno H, Tanaka N, Naito M, Ohashi S, Iwasawa M, Kadoguchi T, Mitomi H, Matsui T, Furukawa H, Fukui N.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 13 Issue: 1 Pages: 18292-18292
  • DOI: 10.1038/s41598-023-45472-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Accumulation of polyunsaturated fatty acid-derived metabolites in the sarcopenic muscle of aging mice (2023)
  • Author(s): Kadoguchi T, Shimada K, Fukui N, Tanaka N, Tsuno H, Shiozawa T, Fukao K, Nishitani-Yokoyama M, Isoda K, Matsushita S, Yokoyama N, Daida H.
  • Journal Title: Geriatrics and Gerontology International Volume: 23 Issue: 4 Pages: 297-303
  • DOI: 10.1111/ggi.14561
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Antibodies against serum anti-melanoma differentia-tion-associated gene 5 in rheumatoid arthritis patients with chronic lung diseases. (2023)
  • Author(s): Oka S, Higuchi T, Furukawa H, Shimada K, Okamoto A, Hashimoto A, Komiya A, Saisho K, Yoshikawa N, Katayama M, Matsui T, Fukui N, Migita K, Tohma S
  • Journal Title: Medicina (Kaunas, Lithuania) Volume: 59 Issue: 2 Pages: 363-363
  • DOI: 10.3390/medicina59020363
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Predisposition of HLA-DRB1*04:01/*15 heterozygous genotypes to Japanese mixed connective tissue disease. (2022)
  • Author(s): Oka S, Higuchi T, Furukawa H, Shimada K, Hashimoto A, Komiya A, Matsui T, Fukui N, Suematsu E, Ohno S, Kono H, Katayama M, Nagaoka S, Migita K, Tohma S.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 9916-9916
  • DOI: 10.1038/s41598-022-14116-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Characteristics of gene expression in frozen shoulder. (2022)
  • Author(s): Nishimoto H, Fukuta S, Fukui N, Sairyo K, Yamaguchi T
  • Journal Title: BMC Musculoskeletal Disorders Volume: 23 Issue: 1 Pages: 811-811
  • DOI: 10.1186/s12891-022-05762-3
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Reversible Improvement of Arterial Stenosis and Wall Thickness in Takayasu Arteritis Through Treatment With Tocilizumab (2022)
  • Author(s): Nogi Shinichi、Yano Yusuke、Kodama Kako、Tsuno Hirotaka、Ogihara Hideki、Kawakami Masahiro、Ohmori Tomoko、Sato Shinji、Matsui Toshihiro
  • Journal Title: Annals of Internal Medicine: Clinical Cases Volume: 1 Issue: 9 Pages: 2767-7672
  • DOI: 10.7326/aimcc.2022.0705
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Physician and patient perceptions of surgical procedures for osteoarthritis of the knee in the United States, Europe, and Japan: results of a real-world study (2022)
  • Author(s): Fukui N, Conaghan PG, Togo K, Ebata N, Abraham L, Jackson J, Berry M, Cappelleri JC, Pandit H.
  • Journal Title: BMC Musculoskeletal Disorders Volume: 23 Issue: 1 Pages: 1065-1065
  • DOI: 10.1186/s12891-022-05954-x
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] 変形性関節症では荷重によって変性軟骨から活性型のTGF-b1が遊離して滑膜病変に関与する (2024)
  • Author(s): 田中信帆、津野宏隆、内藤昌志、岩澤三康、大橋暁、福井尚志
  • Organizer: 日本軟骨代謝学会
• [Presentation] Elucidation of the mechanism for pain and stiffness in knee osteoarthritis focusing on endothelin-1 (2024)
  • Author(s): Hirotaka Tsuno , Nobuho Tanaka, Masashi Naito, Satoru Ohashi , Mitsuyasu Iwasawa, Naoshi Fukui
  • Organizer: 日本軟骨代謝学会
• [Presentation] OA滑膜における血管増生機序の検討 (2023)
  • Author(s): 津野 宏隆, 田中 信帆, 大橋 暁, 岩澤 三康, 古川 宏, 福井 尚志
  • Organizer: 第67回日本リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] 変形性関節症では線溶系の活性亢進によりMMP-1が活性化される (2023)
  • Author(s): 田中 信帆,津野 宏隆,内藤 昌志,岩澤 三康,古川 宏,福井 尚志
  • Organizer: 第67回日本リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] 早期変形性関節症の実態 -分子生物学的な観点から- (2023)
  • Author(s): 福井 尚志,田中 信帆,津野 宏隆,門口 智泰,内藤 昌志,岩澤 三康
  • Organizer: 第96回日本整形外科学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] 変形性膝関節症では滑膜性フレアの時期に関節液中のMMP-1、3の活性が亢進している (2023)
  • Author(s): 田中 信帆,津野 宏隆,門口 智康,内藤 昌志,大橋 暁,岩澤 三康,古川 宏,福井 尚志
  • Organizer: 第38回日本整形外科学会基礎学術集会
• [Presentation] 変形性関節症の滑膜病変における血管新生の発生機序の検討 (2023)
  • Author(s): 津野 宏隆,田中 信帆,門口 智泰,内藤 昌志,大橋 暁,岩澤 三康,古川 宏,福井 尚志
  • Organizer: 第38回日本整形外科学会基礎学術集会
• [Presentation] 変形性関節症では線溶系の活性亢進によりMMP-1が活性化される (2023)
  • Author(s): 田中 信帆、津野 宏隆、内藤 昌志、岩澤 三康、福井 尚志
  • Organizer: 第35回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] 変形性関節症における滑膜内の血管増生機序の検討 (2023)
  • Author(s): 津野 宏隆、田中 信帆、内藤 昌志、岩澤 三康、福井 尚志
  • Organizer: 第35回日本軟骨代謝学会
• [Presentation] 変形性関節症の軟骨変性部ではマトリクスの変化によりプラスミン活性が誘導されている (2022)
  • Author(s): 津野 宏隆、田中 信帆、内藤 昌志、岩澤 三康、福井 尚志
  • Organizer: 第37回日本整形外科学会基礎学術集会
• [Presentation] 変形軟骨におけるプラスミン活性化の機序の解明 －変形性膝関節症における軟骨変性にはプラスミンが関与している－ (2022)
  • Author(s): 津野 宏隆, 田中 信帆, 大橋 暁, 岩澤 三康, 古川 宏, 福井 尚志
  • Organizer: 第66回日本リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] 成人Still病に急性呼吸窮迫症候群を合併した1例 (2022)
  • Author(s): 富永 晃都, 大久 俊輝, 鈴木 智博, 澤田 崇幸, 矢野 裕介, 児玉 華子, 野木 真一, 津野 宏隆, 荻原 秀樹, 小宮 明子, 松井 利浩
  • Organizer: 第66回日本リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] MRSA敗血症診断直後に抗MDA-5抗体陽性の急速進行性間質性肺炎合併Amyopathic Dermatomyositisが発覚した一例 (2022)
  • Author(s): 野木 真一, 鈴木 智博, 大久 俊輝, 矢野 裕介, 澤田 崇幸, 富永 晃都, 児玉 華子, 津野 宏隆, 荻原 秀樹, 松井 利浩
  • Organizer: 第66回日本リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] 高度難治性の痛風性関節炎に対し、外科的処置およびトシリズマブ(TCZ)導入によりコントロールできた一例 (2022)
  • Author(s): 児玉 華子, 大久 俊輝, 鈴木 智博, 澤田 崇幸, 矢野 裕介, 富永 晃都, 野木 真一, 津野 宏隆, 荻原 秀樹, 小宮 明子, 松井 利浩
  • Organizer: 第66回日本リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] 関節リウマチと慢性経過・再燃を繰り返す間質性肺炎を合併する非典型的な経過を呈した抗MDA5抗体陽性皮膚筋炎の一例 (2022)
  • Author(s): 児玉 華子,吉田 智哉,鈴木 智博,中島 塁,大久 俊輝,野木 真一,津野 宏隆,松井 利浩
  • Organizer: 第76回国立病院総合医学会
• [Presentation] 腰部脊柱管狭窄症で手術目的に入院したが、精査にてリウマチ性多発筋痛症と診断、手術することなくステロイド加療で症状改善した一例 (2022)
  • Author(s): 山崎 健,野木 真一,鈴木 智博,中島 塁,津野 宏隆,児玉 華子,大久 俊輝,吉田 智哉,萩原 秀樹,平井 志馬,松井 利浩
  • Organizer: 第76回国立病院総合医学会
• [Presentation] 蛋白尿、補体低下を呈するも、腎生検上、ループス腎炎が否定的だった全身性エリテマトーデス（SLE）の経験 (2022)
  • Author(s): 鈴木 智博, 津野 宏隆, 吉田 智哉, 大久 俊輝, 中島 塁, 児玉 華子, 野木 真一, 堀田 綾子, 荻原 秀樹, 松井 利浩, 齋藤 生朗
  • Organizer: 第32回日本リウマチ学会 関東支部学術集会
• [Presentation] 人工肘関節置換術の生涯戦略をみすえた使い分け (2022)
  • Author(s): 岩澤三康、内藤昌志、大橋 暁、安井哲郎、田中栄
  • Organizer: 第66回日本リウマチ学会総会・学術集会
  • Invited
• [Presentation] 人工股関節全置換術後の反復性前方脱臼に対してCup-in-Cupテクニックで再置換術を行った2例 (2022)
  • Author(s): 戸田義夫、内藤昌志、大橋 暁、岩澤三康
  • Organizer: 第66回日本リウマチ学会総会・学術集会
• [Book] リウマチ科 シクロホスファミド (2022)
  • Author(s): 津野宏隆、松井利浩
  • Total Pages: 7
  • Publisher: 科学評論社
• [Book] 内科 好酸球性多発血管炎症肉芽腫症はさまざまな病像を呈すると聞いたのですが、この病気を見逃さないためにどのような症候に気を付けたらよいでしょうか？ (2022)
  • Author(s): 津野宏隆
  • Total Pages: 3
  • Publisher: ㈱南江堂
• [Patent(Industrial Property Rights)] 変形性膝関節症および肩関節周囲炎の疼痛改善剤 (2023)
  • Inventor(s): 福井尚志、津野宏隆、田中信帆
  • Industrial Property Rights Holder: 福井尚志、津野宏隆、田中信帆
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2023-011513
  • Filing Date: 2023
• [Patent(Industrial Property Rights)] 変形性膝関節症および肩関節周囲炎の疼痛改善剤 (2023)
  • Inventor(s): 福井尚志、津野宏隆、田中信帆
  • Industrial Property Rights Holder: 福井尚志、津野宏隆、田中信帆
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2023