| Project/Area Number |
22K09348
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
池田 敏之 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (80322759)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 軟骨分化 / サイトカイン / TNFスーパーファミリー |
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| Outline of Research at the Start |
1)ヒト間葉系幹細胞に複数のTNFスーパーファミリーを作用させて軟骨分化モデルを構築、RNA sequenceを含めた網羅的解析を行う。
2)構築した軟骨分化モデルでシグナル伝達分子の活性化・不活化状態がどのようなパターンをとるのか評価する。軟骨分化時に不活化されるシグナル伝達系については阻害化合物が軟骨分化誘導能を持つか検討する。
3) マウス・ラットOAモデルを利用して軟骨再生薬の安全性・有効性の評価を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2023年度に解析が終了しなかったLTA（lymphotoxin alpha）およびVEGI（lymphotoxin alpha）のアデノウィルス発現系を作成し、ヒト間葉系幹細胞に導入してin vitro 軟骨分化モデルの構築を試みた。構築済みのTRAIL、GITRLと同様にCOL2A1, SOX6, SOX9など軟骨の初期分化マーカーのmRNA誘導と、ALP染色陽性、alcian blue 染色陽性で示される軟骨基質の産生を認めたが、誘導のスピード・程度については前２者に比べ劣っておりin vitro 軟骨分化モデルとして至適なものではないと判断した。また解析対象の４種類のTNFスーパーファミリーの組み合わせを検討したが、特別に相乗的に働くようなペアは確認できなかった。GITR/GITRLとGFPを組み合わせた融合タンパク発現系（GITR-GFP-L）を作成し、293およびATDC5細胞株への一過性導入により目的蛋白が発現していることをGFPの蛍光観察とWestern blottingにより確認した。アデノウィル発現系を作成しヒト間葉系幹細胞に導入することで、より効果的に軟骨分化が誘導可能なことを確認した。現在このように確立したin vitro 軟骨形成モデルを拡大してRNAを調製し、RNA-sequence解析のための準備を実施している。さらに末梢血由来の単核球分画にNFkBシグナルの転写因子RELAおよびGITR-GFP-Lをアデノウィルスで導入することで軟骨分化を誘導するモデルの構築を試みたが、導入効率が不十分なせいもあってかうまくワークしなかった。レンチウィルス発現系を作成し、精製蛋白投与と組み合わせて再実験を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究の基礎となるin vitro軟骨分化モデルの構築のための検証を行い、TRAIL、GITRLに加え、LTA、VEGIについても軟骨分化誘導能があることを確認したが、当初の予測と異なり、４種類のTNFスーパーファミリーの間に相乗的な効果を見出すことはできなかった。かわりにGITR/GITRLを組み合わせた融合タンパクをアデノウィルス強制発現系でヒト間葉系幹細胞に導入することで効率的なin vitro軟骨分化の確立に成功し、この系を用いてさらなる解析を継続する目途がたった。一方でより汎用性の高いヒト末梢血由来単核球分画を用いたin vitro軟骨形成モデルの作成にも着手したが、この系の確立が予想以上に困難であり、予定外のレンチウィルス発現系の構築や、精製蛋白の投与実験に予定以上の時間的コスト的リソースを費やすことになった。結果として、TNFスーパーファミリーを介した軟骨分化のメカニズムを解析するためのRNA-sequenceや蛋白発現・リン酸化評価を行うにいたらず、またマウス・ラットのOA／軟骨欠損モデルを用いたin vivoの解析にも着手することができなかった。以上を踏まえると、一部想定以上の成果を得た部分はあるものの、研究全体の進捗状況は当初の予定よりやや遅れていると判断するものである。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト末梢血由来の単核球分画を用いたより画期的なin vitro軟骨分化系の確立を引き続き試みるため、RELAやGITR-GFP-Lのレンチウィルス発現系やGITRLやTRAILの精製済み蛋白の投与を組み合わせた検証を引き続き行う。
GITR-GFP-L のヒト間葉系幹細胞へのアデノウィルス導入を利用したin vitro 軟骨形成モデルを用いてRNA-sequence解析により網羅的な発現プロファイルを作成する。得られた発現プロファイルよりパスウェイ解析を行い、誘導・抑制されるリガンド・レセプター、シグナル伝達分子のリストを作成することで軟骨再生薬開発のためのさらなる基礎データとする。さらにTNFスーパーファミリーの下流の細胞内シグナル伝達分子の活性化・不活化を、抗リン酸化蛋白抗体を用いたウェスタンブロッティングやELISAで検証し、実際にどの経路が重要か検証する。軟骨分化時に不活化される経路については、阻害化合物が軟骨分化誘導能を持つかもあわせて検証する。
マウス・ラットOAモデルを利用した軟骨再生薬の安全性・有効性評価：ラットの膝関節軟骨欠損モデルおよび、ラット・マウスの内側半月板および前十字靭帯切除による膝OAモデルを作成後、1～2週後に関節内にin vitro での効果が検証されたGITRL、TRAILやGITR-GFP-Lの融合組み換え蛋白を投与し、一定期間後にサクリファイスして、病理標本用の切片を作成、軟骨損傷・変性・修復の程度を組織学的に検証する。
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