| Project/Area Number |
22K09356
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
宮澤 慎一 岡山大学, 医学部, 客員研究員 (90614925)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中田 英二 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (10649304)
尾崎 敏文 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (40294459)
高尾 知佳 岡山大学, 医歯薬学域, 講師 (40612429)
山田 大祐 岡山大学, 医歯薬学域, 研究准教授 (50733680)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 軟骨再生 / 変形性関節症 / iPS細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
膝関節の軟骨欠損は外傷や変形性関節症などが原因となり、患者数も多い。現在軟骨再生を促進する軟骨再生製品が開発されつつあるが、現時点ではこの臨床ニーズに即した再生医療方法は確立されていない。研究代表者らは、ヒト多能性幹細胞（ES細胞/iPS細胞）を用いて、高い軟骨分化指向性を有し、拡大培養可能で、前向き品質管理が可能なヒト軟骨前駆細胞を大量に調整する技術を開発することと、開発したヒト軟骨前駆細胞を細胞源とし、「球状」の軟骨組織の作製に成功した。本課題では、「シート状」「ペースト状」「懸濁状」の3種類の形状の軟骨組織のモダリティを開発し、膝軟骨欠損モデル動物に移植して有効性を確認することとした。
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| Outline of Annual Research Achievements |
膝関節の軟骨欠損は外傷や変形性関節症などの疾患が原因で患者数も多い。申請者らはヒト多能性幹細胞（ES細胞/iPS細胞）を用いて、高い軟骨分化指向性を有し、拡大培養可能で、前向き品質管理が可能なヒト軟骨前駆細胞を大量に調整する技術を開発した。また開発したヒト軟骨前駆細胞を細胞源とし球状の軟骨組織の作成に成功した。本課題ではシート状の形状の軟骨組織のモダリティを開発し、膝軟骨欠損モデル動物に移植して有効性を確認することとした。
ヒト軟骨前駆細胞の準備：ヒトiPS細胞株３種（414C2, HPS1042, 771-3G, CiRA HLAホモドナー株）をPrimitive streak誘導培地で1日処理後、側板中胚葉誘導培地で1日処理した。この後CHIR(GSK3b inhibitor),A83-01(ALK5 inhibitor),FGF2で処理し、ヒト軟骨前駆細胞へ誘導させた。5-6継代培養し細胞ストックを各ロットにて10本準備した。各ロットの細胞品質は（1）特定のCD抗原の発現（CD90陽性CD140B陽性CD82陰性）と、（2）2/3次元培養による軟骨細胞分化能・球状組織塊の軟骨組織の形成能で評価した。
シート状の移植用素材の作製：ヒト軟骨前駆細胞を温度感受性シート(CellSeed社)に播種し軟骨分化誘導培地（bone morphogenetic protein 4, Transforming Growth Factor-β, Growth Differentiation Factor 5）で処理し成熟軟骨細胞シートを得た。播種細胞密度や分化誘導培地処理期間を検討した。性状はAlcianBlue/SafraninO染色での組織解析や、Collagen IIやAggrecanの免疫染色/qPCRで確認した。本素材を軟骨欠損モデルに移植し、軟骨再生が得られることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト軟骨前駆細胞の準備：ヒトiPS細胞株３種（414C2, HPS1042, 771-3G, CiRA HLAホモドナー株）を、Primitive streak誘導培地にて1日処理後、側板中胚葉誘導培地にて1日処理した。この後、CHIR(GSK3b inhibitor)、A83-01(ALK5 inhibitor)、FGF2にて処理することで、肢芽間葉系細胞（＝ヒト軟骨前駆細胞）へ誘導させた。5-6継代培養し、細胞ストックを各ロットにて10本準備した。各ロットのヒト軟骨前駆細胞の品質（軟骨形成能の前向き評価）は、（1）特定のCD抗原の発現（CD90陽性CD140B陽性CD82陰性）と、（2）2/3次元培養による軟骨細胞分化能・球状組織塊の軟骨組織の形成能より評価した。
シート状の移植用素材の作製：ヒト軟骨前駆細胞を、温度感受性シート(CellSeed社)に播種し、軟骨分化誘導培地（bone morphogenetic protein 4, Transforming Growth Factor-β, Growth Differentiation Factor 5）にて処理することにより成熟軟骨細胞シートを得た。この際、播種細胞密度や、分化誘導培地処理期間を検討する。性状は、AlcianBlue/SafraninO染色による組織解析や、Collagen IIやAggrecanの免疫染色/qPCRにより確認した。本素材を軟骨欠損モデルに移植し、軟骨再生が得られることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、さらに、移植3-6か月後に移植組織体の性状・ホスト側組織との適合性を確認し、移植したヒト軟骨前駆細胞/軟骨組織体を組織学的観察（硝子軟骨マーカーであるSafranin O染色や、Type II collagen/Type X collagen/PRG4などの軟骨組織マーカーの免疫染色）を実施する。
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