| Project/Area Number |
22K09379
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
中佐 智幸 広島大学, 医系科学研究科(医), 寄附講座准教授 (60467769)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石川 正和 香川大学, 医学部, 教授 (60372158)
味八木 茂 広島大学, 病院(医), 特定教授 (10392490)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 関節軟骨 / 骨棘 / 変形性関節症 / microRNA |
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| Outline of Research at the Start |
変形性関節症(OA)は、広範囲の軟骨欠損等により関節変形と著しい疼痛をきたす。末期になると人工関節置換術しか治療法がなく、低コストで広範囲に関節軟骨を再生できる新たな治療法の開発が望まれている。本研究では、末期OAでみられる骨棘内の軟骨を細切しアテロコラーゲンゲルに包埋して軟骨欠損部に移植し関節軟骨を再生する治療法の確立を目指す。そのために、骨棘軟骨と関節軟骨の差を詳細に解析する。特にmicroRNAに着目し、骨棘軟骨のmicroRNA発現を制御して関節軟骨の形質に転換させる。細切骨棘軟骨とmicroRNAを組み合わせてアテロコラーゲンゲルに包埋し、日本白色家兎の骨軟骨欠損に移植してその治療効果を評価する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
人工膝関節置換術で廃棄される関節軟骨と骨棘を採取した。切片を作製し、組織学的評価を行った。骨棘軟骨もⅡ型コラーゲンの発現を認めたがX型コラーゲンの発現は骨棘軟骨の方が関節軟骨より多かった。Ki67の発現を調べたところ、骨棘軟骨の方が発現が多かった。関節軟骨・骨棘軟骨からRNAを抽出し、RNAシークエンスを行ったところ、骨棘軟骨では、関節軟骨より骨形成を促す遺伝子発現が強かったが、COL2A1、SOX9、ACANの発現に差はなかった。
それぞれを約1mm3に細切し、アテロコラーゲンゲルに包埋してそれぞれ3、6週間培養する群とそれぞれの軟骨から酵素処理により細胞を単離し、アテロコラーゲンゲルに包埋し、3、6週間培養する群を作製した。切片を作製し、サフラニンO染色とHE染色を行った。ゲル内に遊走している細胞はLECT1陽性細胞であり、軟骨細胞であった。細胞数を計測したところ、細切した軟骨は両群とも3週より6週で有意に増加していた。6週まで培養しても軟骨組織が骨化することはなかった。関節軟骨、骨棘軟骨から軟骨細胞を単離し、MTTアッセイにより細胞増殖能を比較したところ、骨棘軟骨の方が関節軟骨より増殖能が大きかった。さらにゲル内のプロテオグリカン量を計測すると骨棘軟骨でも関節軟骨と同程度のプロテオグリカン量をゲル内に有することがわかった。これらの結果から、骨棘軟骨の方が関節軟骨より遊走能が高く、ゲル内で骨棘由来の軟骨細胞であってもプロテオグリカンを産生することがわかった。以上をまとめ、国際誌に投稿し、採択された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
関節軟骨と骨棘軟骨との性質の差を示し、関節軟骨修復に際して、骨棘軟骨を用いても関節軟骨と同程度の修復が得られる可能性があることをまず証明することを目的としており、RNAシークエンスによる網羅的な遺伝子発現解析により、骨棘軟骨は関節軟骨と同じ軟骨としての特徴を有していることを明らかにできた。また、関節軟骨再生に使用するアテロコラーゲンゲル内に骨棘軟骨を包埋して培養したところ、ゲル内に軟骨基質を産生することを確認できた。当初、骨棘軟骨が軟骨基質を産生できるのか不明で、軟骨基質をゲル内に産生できないとなると研究の進行が滞ると思っていたため、in vitroの実験はほぼ予定通り進めることができた。ゲル内に遊走している細胞が軟骨細胞であることを示す必要があったが、免疫染色も問題なく行うことができ、良好な結果を得ることができた。In vitroの実験はほぼ予定通り進んでおり、in vivoの実験を行う準備を併せて行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの実験で、骨棘軟骨由来の細切軟骨により、ゲル内に軟骨細胞が遊走しプロテオグリカンを産生することがわかった。また、軟骨特異的遺伝子であるCOL2A1、SOX9、ACANの発現は骨棘軟骨と関節軟骨で同等であった。つまり、関節軟骨修復の細胞源として有用である可能性が示唆されたので、今後は、実際に日本白色家兎の軟骨欠損部に骨棘軟骨を移植してその治療効果を検証する予定である。RNAシークエンスの結果から骨棘軟骨は、関節軟骨の要素を持ちながら、関節軟骨より骨形成の要素が強いことがわかったため、骨形成を抑制するmicroRNAを制御することでより骨棘軟骨を関節軟骨に近づけることを目指していく。
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