Development of new molecular targeted therapy for osteosarcoma lung metastasis

Research Project

Project/Area Number	22K09401
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 56020:Orthopedics-related
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	中田英二岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (10649304)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宝田剛志岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (30377428) 尾崎敏文岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (40294459) 高尾知佳岡山大学, 医歯薬学域, 講師 (40612429) 山田大祐岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (50733680)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	悪性骨・軟部腫瘍 / 肺転移 / 増殖 / PRRX1 / 骨肉腫
Outline of Research at the Start	骨肉腫の20-30%は肺転移を起こし予後不良である。最近、間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)に発現するPaired related homeobox 1 (PRRX1) という遺伝子が転移に関与すると報告されている。我々は、PRRX1の発現を抑制するとin vivoで肺転移が抑制されることを確認することにした。また、PRRX1の機能解析を行うため、PRRX1を過剰発現あるいはノックダウンさせた細胞とコントロールで発現する遺伝子をRNA sequencingを用いて比較し、遠隔転移のメカニズムの解明やPRRX1の下流シグナル経路を解析することとした。
Outline of Annual Research Achievements	骨肉腫悪性骨・軟部腫瘍は標準治療として化学療法と手術が行われる。しかし、肺転移に対する化学療法の効果は限られ、極めて予後不良である。近年、分子標的薬が登場しているが、肺転移例の予後改善は困難で、有効な新規治療薬の開発が期待されている。転写制御因子Paired related homeobox 1(PRRX1)は、四肢骨格形成に強く関与しており、その重要性に関する報告も多い。一方で、がんの悪性化への関与も報告されており、我々は骨肉腫において、PRRX1が悪性化促進因子として機能することを明らかにした。そこで、骨肉腫など、悪性骨・軟部腫瘍におけるPRRX1の役割を解明するため、腫瘍の悪性度とPRRX1の発現量の関連性を臨床的に評価し、in vitroにおける機能解析を行った。当院にて手術を行った悪性骨・軟部腫瘍の術後検体にPRRX1の免疫染色を行い、染色強度と染色陽性細胞数から高発現群と低発現群に群分けし、PRRX1の発現とその患者の５年累積生存率、再発・肺転移との関連を評価したところ、免疫染色において、高発現群は低発現群に比べ５年累積生存率が低く、転移率が高かった。in vitroでは、レンチウイルスベクターを用いてPRRX1に対するshRNA(shPRRX1)を複数の肉腫細胞株に導入した。またPiggybac systemを用いてPRRX1をドキシサイクリン依存的に過剰発現させるヒトMPNST細胞株を樹立した。対照群(空ベクター導入群)とshPRRX1導入群間、対照群(ドキシサイクリン未処理群)とPRRX1過剰発現群(ドキシサイクリン処理群)間で増殖能、遊走能、浸潤能を比較した。またshPRRX1導入群では増殖能、遊走能、浸潤能が低下し、PRRX1過剰発現群では増殖能に変化はないが、遊走能、浸潤能が増加していることが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 骨肉腫など、悪性骨・軟部腫瘍におけるPRRX1の役割を解明するため、腫瘍の悪性度とPRRX1の発現量の関連性を臨床的に評価し、in vitroにおける機能解析を行った。当院にて手術を行った悪性骨・軟部腫瘍の術後検体にPRRX1の免疫染色を行い、染色強度と染色陽性細胞数から高発現群と低発現群に群分けし、PRRX1の発現とその患者の５年累積生存率、再発・肺転移との関連を評価した。免疫染色において、高発現群は低発現群に比べ５年累積生存率が低く、転移率が高かった。in vitroでは、レンチウイルスベクターを用いてPRRX1に対するshRNA(shPRRX1)を複数の肉腫細胞株に導入した。またPiggybac systemを用いてPRRX1をドキシサイクリン依存的に過剰発現させるヒトMPNST細胞株を樹立した。対照群(空ベクター導入群)とshPRRX1導入群間、対照群(ドキシサイクリン未処理群)とPRRX1過剰発現群(ドキシサイクリン処理群)間で増殖能、遊走能、浸潤能を比較した。またshPRRX1導入群では増殖能、遊走能、浸潤能が低下し、PRRX1過剰発現群では増殖能に変化はないが、遊走能、浸潤能が増加していることが分かった。
Strategy for Future Research Activity	今後は、PRRX1の機能解析として、遠隔転移のメカニズム、シグナル経路の解析を予定している。方法として、PRRX1を過剰発現やノックダウンした細胞とコントロールから遺伝子を抽出しRNA Sequencingで発現する遺伝子を比べる。コントロールに比べ発現が増加あるいは低下している遺伝子を検討し、PRRX1の発現上昇による肺転移のメカニズムの解明やPRRX1の下流シグナル経路を解析する。また、解析されたシグナル経路と同様の動向を示す薬剤の特定を行う。特定されたEMT のmolecular markers であるN-cadherin, E-cadherin や核内のβ-catenin とWnt/β-catenin のターゲットである c-Myc.のレベルが上昇するかを検討する。またその下流シグナルと同様の動向を示す薬剤を特定する。