自家組織を犠牲にしない新規骨再生療法の開発

Research Project

Project/Area Number	22K09423
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 56020:Orthopedics-related
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	新倉隆宏神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (40448171)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	大江啓介神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (20514623) 福井友章神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (50437688) 澤内健一神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (20965793) 隈部洋平神戸大学, 医学部附属病院, 医員 (40980751)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	骨再生
Outline of Research at the Start	骨を失った患者の治療には今でも自家骨移植手術が行われることが標準的である。しかし自家骨移植には健常部への侵襲、合併症リスクが不可避で、採骨量の限界、ドナーとレシピエントで骨の形状が一致しないという問題もある。本研究では、自家骨移植に取って代わる「自家組織を犠牲にしない新規骨再生療法の開発」を目的とする。骨再建外科のトピック局所生体膜誘導と骨形成因子、さらに既存物には無い工夫を加えた人工骨を融合し、自家骨を一切使用しない骨再生医療の研究、開発を行う。
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、自家骨移植に取って代わる、将来臨床で実用可能な「自家組織を犠牲にしない新規骨再生療法の開発」である。令和5年度の研究実施計画は（１）BMPと人工骨、induced membraneを利用した骨再生に関するin vivo試験を継続することに加え、（２）3D構造再現・表面加工人工骨の開発と、それを用いた骨再生に関するin vitro試験、in vivo試験を行うことであった。（１）については、ウサギを用いた実験で大腿骨骨幹部に骨欠損を作成し実験を行った。骨セメントを欠損部に4週間留置することでinduced membraneを作成することができた。骨欠損部を架橋プレート固定し骨欠損部に自家腸骨を移植することで骨癒合する動物モデルを確立した。これをコントロールとし、自家骨移植の代わりにBMP-2含有人工骨（beta-tricalcium phosphate: beta-TCP）を充填した実験群とで骨再生をX線学的、組織学的に評価した。さらに摘出大腿骨の力学的強度を比較検討した。その結果、BMP-2含有人工骨の自家骨に対する非劣勢が認められた。自家骨移植にとって代わる、採骨という侵襲を患者に与えない新たな骨再生療法開発に繋がる有意義な結果を得ることができた。（２）については、ウサギの大腿骨遠位部の微細構造を3Dプリンタで再現する人工骨を作成することに成功した。in vitro試験で細胞毒性に問題なく、細胞接着が良好であることを確認した。hydroxyapatite, beta-TCPを基材として作成できている。これをウサギの大腿骨遠位部に作成した骨孔に埋植しX線学的、組織学的に評価したところ、いずれにおいても良好な骨再生を示した。両者を比較するとbeta-TCPの方がより良い骨再生が認められた。3D人工骨作成においてbeta-TCPが適切な基材となることが分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason BMPと人工骨、induced membraneを利用した骨再生に関するin vivo試験については、コントロール群の作成において当初考えていたよりは難渋した。このせいで、BMPと人工骨、induced membraneのみで骨再生を行う実験群の評価を行う時期が当初計画よりは次年度になった。そのため、この研究においては当初予定よりも研究の進捗はやや遅れている。プレート固定という手法を用いることで、自家骨移植によって骨癒合へと導けるコントロール動物モデルを確立することができたので、課題は解消された。一方、3D構造再現・表面加工人工骨の開発と、それを用いた骨再生に関するin vitro試験、in vivo試験は順調に進んでおりいる。3Dプリンタ光造形技術を用いて、骨のマクロ構造だけでなく海綿骨、骨梁構造を再現することができた。3Dプリンタ光造形技術による造形を順調に達成することができ、造形物をウサギの骨欠損部に埋植する実験も当初計画通りに実施できた。このように、前者の研究の進捗はやや遅れているが、後者の進捗は順調であり、総合的に評価し、当初計画よりやや遅れていると考えている。
Strategy for Future Research Activity	3D構造再現・表面加工人工骨の開発と、それを用いた骨再生に関する研究においては、3Dプリンタを用いた光造形技術のさらなる洗練に加えて、既存人工骨には無い下記の工夫を加えていく。人工骨基材に炭酸塩、マグネシウム、非晶質ハイドロキシアパタイト等を表面修飾することで骨伝導性、吸収性、BMP吸着能を増加する。ウサギ大腿骨のマクロ・ミクロ構造を再現した人工骨を作成し、これを用いてin vitro試験、in vivo試験を行う。 in vitro試験：開発人工骨ディスクを間葉系幹細胞とともに培養する。細胞の付着・浸潤を走査電子顕微鏡で、細胞毒性をCCK-8 assay, LDH assayで評価する。BMP-2、transforming growth factor-beta3存在下での培養で骨芽細胞系分化、軟骨細胞系分化を評価する。血管新生をtube formation assayで、CaとPの溶出を比色試験で評価する。 in vivo試験：ウサギ大腿骨の骨欠損部にこれと同じ形状に作成した人工骨を埋植し、骨形成、骨癒合をX線学的、組織学的に評価し、骨強度を力学試験で測定する。