サルコペニア治療標的としてのRNA結合タンパク質Acin1の機能解析
| Project/Area Number |
22K09425
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
|
|---|
| Research Institution | Ehime University |
|---|
Principal Investigator |
青戸 守 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (50372727)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
酒井 大史 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (00820804)
今井 祐記 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (10423873)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
|
|---|
| Keywords | RNA結合タンパク質 / Acin1 / 骨格筋 / 選択的スプライシング |
|---|
| Outline of Research at the Start |
我々は選択的スプライシング（Alternative Splicing: AS）への関与が知られるRNA結合タンパク質Acin1が筋線維に多く発現していることを見出しており、本研究では、独自に作製したAcin1Floxマウスを用いて骨格筋特異的Acin1欠損マウスを作製し、骨格筋の機能や筋損傷からの再生過程におけるAcin1の生理機能を明らかにする。更にゲノムワイドな解析によりAcin1がASを制御する遺伝子群を明らかにする。これにより、将来的にAcin1の機能制御を介して、あるいは直接的に、骨格筋の機能に必要なASイベントを誘導し、筋委縮や筋損傷の予防・治療法の開発を目指す。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
近年、選択的スプライシング（Alternative Splicing: AS）の機能不全による疾患に対してAS調節を標的とする薬剤の開発が注目されている。骨格筋においてもASの機能不全が多数知られており、疾患の予防・治療法開発の標的となりうる。申請者らはこれまでに、ASへの関与が知られるRNA結合タンパク質Acin1が筋間質細胞や筋衛星細胞に比べて筋線維に多く発現していることを見出し、筋線維特異的にCreを発現するHSA-Cre Tgマウスと申請者が独自に作製したAcin1Floxマウスを用いて筋線維特異的Acin1遺伝子欠損マウス（KOマウス）を作製した。KOマウスは胎生致死や出生時に死亡することなく出生し、対照マウスと比較して生存率や体重に有意な差はなかったが、KOマウスにおいて下肢骨格筋重量や筋線維断面積、中心核数、筋再生マーカーeMyHCの発現が対照マウスに比べて有意に増加していた。更にKOマウスと対照マウスの前脛骨筋に対してRNA-seq解析を行い、KOマウスでmRNA量が増加した遺伝子のGOエンリッチメント解析を行ったところ骨格筋線維の発生や収縮に係るGOタームが検出された。また、KOマウスにおいて有意にASが変化している遺伝子を解析し、GOエンリッチメント解析を行った結果、骨格筋線維の発生や分化、構造に係るGOタームが検出された。このことから、Acin1遺伝子の欠損により筋線維に何らかの障害が起こり、その結果、代償的に筋肥大が起こっている可能性が示唆された。これらの結果について第101回日本生理学会大会においてポスター発表を行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度までの研究において、申請者らは骨格筋線維特異的Acin1遺伝子欠損マウス（KOマウス）を独自に作製し、以下のことを明らかにしている。（１）KOマウスは胎生致死となることなく出生し、対照マウスと比べて雌雄ともに生存率や体重に有意な差がなかった。（２）１２週令のKOマウスにおいて前脛骨筋（TA）、腓腹筋（GA）、ヒラメ筋（SOL）の筋重量や筋線維横断面での中心核数が対照マウスに比べて有意に大きかった。（３）KOマウスのTAにおいて筋線維横断面積が増大し、筋再生マーカーeMyHCの発現が対照マウスに比べて有意に増加していた。（４）KOマウスと対照マウスのTAに対してRNA-seq解析を行い、KOマウスでmRNA量が増加した遺伝子のGOエンリッチメント解析を行ったところ骨格筋線維の発生や収縮などのGOタームが検出された。（５）RNA-seqデータを、２種類のAS解析ソフトウェアを用いて解析したところ、それぞれ44個と16個のASイベントの変化が検出された。それらについてGOエンリッチメント解析を行ったところ、骨格筋線維の発生や分化、構造に係るGOタームが検出された。
これらの結果から、Acin1遺伝子の欠損が直接筋肥大を誘導するのではなく、Acin1遺伝子の欠損により筋線維に何らかの障害が起こり、代償的に筋肥大が起こっている可能性が示唆された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は以下の解析を行うことにより「Acin1が骨格筋においてどのようなASイベントに関わり、骨格筋の発生・再生過程にどのように寄与するのか」を明らかにする。
（１）対照マウスと比較してKOマウスでASに変化のあった遺伝子をAcin1が制御する骨格筋特異的ASイベントとし、その結果、タンパク質の発現が変化するかどうか、また、その遺伝子が係るシグナル伝達系に変化が生じるかどうかをウエスタンブロットや蛍光免疫組織化学により解析する。
（２）野生型マウスの骨格筋に対して、抗Acin1抗体を用いたCLIP（UV架橋免疫沈降）-seqを行い、Acin1が結合するRNAを網羅的に解析する。（１）の結果と合わせて、Acin1がRNAに直接結合してASを制御する遺伝子（Acin1制御遺伝子）を同定する。更にRNA上のAcin1結合部位の同定も行う。
（３）（２）で同定したAcin1制御遺伝子の、ASを受けるエクソンとイントロンおよびAcin1結合部位を含むレポーターミニジーンを作製し、Acin1発現プラスミドとともにHEK293細胞に導入する。導入したレポーターミニジーンのASイベントをRT-PCRにより解析し、GFP発現プラスミドの場合と比較する。これによりAcin1が直接ASイベントを制御していることを証明する。
（４）（２）で同定したAcin1制御遺伝子の発現コンストラクトを筋芽細胞株C2C12細胞に導入し、ミオシン重鎖を発現する細胞の割合を計測することにより骨格筋分化に与える効果を評価する。
|
Report
(2 results)
Research Products
(1 results)
