変形性膝関節症の疼痛増強におけるTRPA1チャネルの役割とその抑制効果

• Project/Area Number: 22K09431
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 56020:Orthopedics-related
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 玉井 英伸 和歌山県立医科大学, 医学部, 客員研究員 (20838726)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山中 学 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (30597084) ; 西尾 尚子 和歌山県立医科大学, 医学部, 特別研究員 (40648359)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000); Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: TRPA1 / OA / sEPSC / AITC / HC-030031 / PAM / CatWalk / Osteoarthritis / 変形性膝関節症

Outline of Research at the Start

本研究では膝OAの関節内にTRPA1が発現することを確認し、in vivo パッチクランプ法を用いて脊髄後角細胞における膝OAモデルの関節内TRPA1活性の作用を解明する。さらに、行動学実験で膝OAモデルの関節内TRPA1チャネルの活性化および阻害の影響を明らかにする。これにより、新たな膝OA用鎮痛薬開発の一助となることを証明する。

Outline of Annual Research Achievements

1.膝OAモデルラットの後根神経節におけるTRPA1発現の検討　イソフルラン麻酔下のラットを4％パラホルムアルデヒドで灌流固定し、後根神経節を切除し、10％ホルマリン緩衝液で固定後、を20％スクロース入りリン酸バッファーで処理し、凍結した。凍結組織をクリオスタットにて薄切し、スライドガラスに貼り付け免疫染色用状本を作成した。内在性ビオチンの影響を省くための3％過酸化水素水処理した試料に抗TRPA1抗体を反応させ、ペルオキシダーゼ反応によるDAB発色によりTRPA1の発現を検出した。
2.CatWalkによる歩行解析　CatWalk XT(Noldus Information Technology,The Netherlands)のシステムを用いて実験を行った。自然歩行下の後趾の接地面積、歩行時間（接地時間や趾の振り出し時間）、後趾の協調を記録し、健側‐患側比で比較した。TRPA1作動薬/拮抗薬/生理食を関節内に投与前と投与後(30分、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間) にラットの歩行解析を行うことで、患肢の疼痛が軽減しているかを検討した。
3.Pressure Application Measurement（PAM）による疼痛閾値の評価　疼痛閾値の評価として侵害受容器へ直接圧迫するPAM(Ugo-Basile, Italy)を用いて行った。実験者は専用のトランスデューサーを親指に装着し、ラットの膝関節を圧迫し、逃避行動をとるまでの圧を測定し、健側‐患側比で比較した。記録は投与前、投与後30分、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間で計測した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

特に問題なく進捗している

Strategy for Future Research Activity

今後もパッチクランプのデータ収集をIn-vivoで継続する。
また、今後はOAモデルに対するTRPA1発現を確認するため、ラットのDRGを免疫染色する。また、OAモデルに対し、各試薬を投与後、行動学実験でどのような結果を示すか実験を行う。
尚、行動学実験はPAM、 von Frey test、Hot Plate test, CatWalk等を予定している。