患者由来ゼノグラフトを用いたCDK12変異前立腺癌のPARP阻害薬不応性の克服

Research Project

Project/Area Number	22K09446
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 56030:Urology-related
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	後藤崇之京都大学, 医学研究科, 講師 (90806605)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小林恭京都大学, 医学研究科, 教授 (00642406) 赤松秀輔名古屋大学, 医学研究科, 教授 (20767248)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	CDK12異常前立腺癌 / 去勢抵抗性前立腺癌 / ATM阻害薬 / PARP阻害薬 / PDX / 前立腺癌 / CDK12 / 相同組換え修復関連遺伝子 / 患者由来ゼノグラフト
Outline of Research at the Start	近年、去勢抵抗性前立腺癌の約11%の症例で相同組換え修復関連遺伝子の1つであるCDK12の変異が報告され、難治性であり新規治療の開発が望まれている。CDK12変異前立腺癌においては有用な基礎研究モデルが存在しなかったが、申請者は患者検体由来ゼノグラフトを用いることで、投薬実験と機能解析が可能な実験モデルを確立した。本研究はPARP阻害薬とATR阻害薬の併用投与を治療候補として、その有効性の確認と作用機序の解明を行い、臨床応用を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	1 CDK12変異前立腺癌患者由来ゼノグラフト(PDX)を用いた投薬実験・機能解析 2名のCDK12変異前立腺癌患者から独自に樹立したPDXであるKUCaP18・KUCaP21と、コントロールとしてCDK12変異を有さない去勢抵抗性前立腺癌PDX、KUCaP12を用いて、PARP阻害薬単剤群、ATR阻害薬単剤群、併用投与群およびvehicle群の4群にわけ投薬実験を行った。その結果、KUCaP18・21では併用群でのみ有意差をもって抗腫瘍効果を認め、ウエスタンブロッティングでDNA2本鎖損傷マーカーであるγH2AXの上昇を認めた。オフターゲット効果の排除のため異なるPARP阻害薬・ATR阻害薬の併用投薬実験でもやはり抗腫瘍効果を認めた。一方KUCaP12ではどの併用群も効果を認めなかった。以上からCDK12異常のあるPDXにおいてPARP阻害薬・ATR阻害薬の併用投与の効果を認めた。また有害事象評価として治療後の肝臓・腎臓の組織学的検索および血球数検索においては投薬群とvehicle群で有意差を認めなかった。 2 細胞株を用いたPARP阻害薬とATR阻害薬の作用機序の解明我々が作成したCDK12KO(ノックアウト)前立腺癌細胞株と親株とでATR阻害薬の投薬実験においてCDK12KO細胞株で増殖抑制を認めた。RNAポリメラーゼIIのリン酸化を介してDNA修復遺伝子の制御を行うと考えられているCDK12に対してKOを行うとpSer2 CTDの変化を伴った下流の発現変化が期待されるなか、DNA損傷下（CPT11投与下）の前立腺癌細胞におけるCDK12KOのウエスタンブロッティングではpSer2 CTDに変化なくDNA修復遺伝子であるATMの発現が低下していた。このことからCDK12KO下においては、従来とは異なるATMの下流の制御機構を介して媒介される可能性が考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の計画通り、細胞株を用いたPARP阻害薬とATR阻害薬の作用機序の解明を終えている。
Strategy for Future Research Activity	1　細胞株を用いたPARP阻害薬とATR阻害薬の作用機序の解明(後藤/小林) DNA損傷下の PCa 細胞における CDK12KOの機能はATMの下方制御を介して媒介される可能性についてさらなる検証をする。具体的には、CDK12KO細胞における相同組み換え修復機能をDR-GFPというレポーターを導入し検討する。さらには共役分子が影響していないかについても、siRNAでノックダウンを行い検証する。 2　オルガノイドを用いた作用機序の解明 CDK12変異PDX由来オルガノイド(コントロール株)を用いてshATRオルガノイド株(shATR株)を作成し、PARP阻害薬とATR阻害薬をコントロール株に併用投与し、他方でPARP阻害薬をshATR株に単剤投与を行う。細胞株と同様にATR阻害薬の有効性を評価する。コントロール株及びshATR株をマウスに再移植(オルガノイド移植ゼノグラフト)し、PDX投薬実験の再現性が得られるか確認する。shATR株群では、PARP阻害薬単剤の投薬実験により、ATR阻害薬による腫瘍縮小がオフターゲット効果でないか検証する。