| Project/Area Number |
22K09663
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56050:Otorhinolaryngology-related
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
相古 千加 富山大学, 学術研究部医学系, 助教 (10523889)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
入江 智彦 国立医薬品食品衛生研究所, 薬理部, 主任研究官 (20546551)
伊藤 哲史 富山大学, 学術研究部医学系, 教授 (90334812)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 単一核RNAシークエンス / auditory system / Single cell RNA‐Sequence / Single nucleus RNA‐seq / 聴覚 / 難聴 / 耳鳴り / 分子メカニズム / Single cell / RNA sequence |
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| Outline of Research at the Start |
耳鳴は高齢者のQOLを低下させる要因の一つであり、治療法の開発は急務である。このためには、耳鳴の発生部位である下丘の神経回路、病的状態での変化、耳鳴発症機序を解明することが必要である。しかし、下丘の正常神経回路の構成要素の詳細も機能変化も不明である。
本研究は、①下丘神経回路の細胞種を同定する②それらが発現する遺伝子群を正常、難聴動物で網羅的に同定する③細胞種のマーカー遺伝子を明らかにする④その遺伝子の機能阻害の影響を形態学と生理学から明らかにする⑤マーカー遺伝子のCreマウスを作製し神経活動の制御を行う。
本研究では耳鳴の改善効果を行動学的に検証し、得られる成果は耳鳴の治療法の開発に貢献する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
耳鳴、難聴は高齢者のQOLを低下させる要因の一つであり、治療法の解明は高齢化社会における急務である。これまでに、中枢聴覚神経路の上位核である下丘や内側膝状体での抑制性神経伝達GABAの減少が耳鳴の原因であることが示唆されている。しかし、耳鳴病態での個々の細胞種の神経活動は不明であった。本研究では耳鳴りの発生機序の解明、治療法につなげることを目的とし、まず下丘大型抑制性細胞の特異的マーカー遺伝子を同定し、次にその遺伝子の機能を明らかにし、最後にマーカー遺伝子に対するCreマウスを作成し、遺伝子ツール（DREADD法）を用いる事で大型抑制性細胞依存的な神経活動のリアルタイム制御を行うという計画である。
研究計画を立案した段階では、 Single cell RNA sequence を行う予定だったが、聴覚に関連する神経細胞を生細胞として調整するのは困難であり、それを克服する方法として、Single nucleus RNA sequence の方法を確立した。また、核を用いることで、脳組織を凍結保存することが可能となった。このためSingle nucleus RNA Sequence法に切り替えて実験を行った。
正常マウスと音爆による難聴モデルマウスを用いて、Single nuleus からRNAを抽出し、sequencing 用のlibraryを調整して遺伝子発現の比較を行った。また、蝸牛を破壊することによる完全難聴モデルマウスも作成して、Libraryを調整し、RNA Sequenceを行った。
正常マウスと難聴モデルマウスの遺伝子発現の比較から、いくつかの遺伝子をマーカー遺伝子候補として、これらについて、 in situ hybridization 法により、マウス脳における発現分布、局在の解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
蝸牛を破壊した完全難聴モデルマウスから調整したLibrary を用いたRNA sequence 解析の結果、クラスター分類が期待したほど行うことができなかった。この原因は、調整したRNAの質に問題があった可能性がある。このことから、再度RNA sequenceを行うことが必要となった。
また、いくつかのマーカー候補遺伝子について、in situ hybridizationによるマウス脳における遺伝子発現の局在分析を行っているが、予定よりも時間がかかってしまっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
さらにSingle nucleus RNA Sequenceを行って、精度を上げる。
また、候補遺伝子を増やして in situ hybiridization、免疫組織化学染色等による遺伝子発現の局在を調べることにより、よりよいマーカー遺伝子の特定を行う
培養神経細胞にマーカー遺伝子に特異的なsiRNA を導入することにより、マーカー遺伝子の神経細胞における機能解析を行う。
パッチクランプ法等による生理的機能解析も行う
マーカー遺伝子の下流に2A-CreをCRISPR-Cas9による相同組換えによってknock inした遺伝子改変マウスを作成し、マーカー遺伝子発現時にCreリコンビナーゼも発現するCreマウスを得る。この動物の下丘にAAV-FLEX-hM4Di を注入し、DREADD技術により大型抑制性細胞の興奮性を抑制し、下丘内及び聴覚視床の GABAを減少させる行動実験によってこの動物の耳鳴行動の変化を調べる
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