| Project/Area Number |
22K09760
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56060:Ophthalmology-related
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
菅野 江里子 岩手大学, 理工学部, 准教授 (70375210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富田 浩史 岩手大学, 理工学部, 教授 (40302088)
田端 希多子 岩手大学, 理工学部, 特任准教授 (80714576)
小松 三佐子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 客員研究員 (00525545)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | アデノ随伴ウイルス / 視細胞 / オプトジェネティクス / 遺伝子導入 / 網膜 |
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| Outline of Research at the Start |
我々が新規に開発した光感受性クロライドイオンチャネルChimGt12 （特許出願PCT/JP2021/012283）を変性前の視細胞に発現させることで、変性を遅延させることに成功した。しかしながら、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV) の網膜下投与により遺伝子導入を行ったために、その効果は遺伝子発現部位に限局していた。より広範囲に遺伝子導入を行うことで、保護効果を高められる可能性がある。
本研究では、バイオインフォマティクスによりAAVのcapsidタンパク質を新たにデザインすると共に、細胞への透過性を改善する薬剤の検討により、硝子体内投与でも、効率よく視細胞へ遺伝子導入を行う方法を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は新規光感受性クロライドイオンチャネルChimGt12を始めとした様々な特性を持つオプトジェネティクス遺伝子を開発している。実験において、視細胞変性前の視細胞へChimGt12を発現させることで、局所において変性を遅延させることに成功した。しかしながら、視細胞をターゲットとした遺伝子導入のためアデノ随伴ウイルス(AAV)の網膜下投与を行った結果、遺伝子導入部位が投与部に限局されていた。我々の遺伝子は、視細胞変性を阻止する効果を期待しており、想定している希望遺伝子導入部位は、網膜周辺部を含めた広範囲である。そのため、より広く視細胞への遺伝子導入を行うAAVが必要である。硝子体から視細胞へ遺伝子を到達させるAAVベクターについて報告のあるものの、我々のラットを用いた実験結果では、効率が極めて低いものであった。
本研究では、広範囲に遺伝子導入を行うためのベクターおよび細胞へのAAV送達を改善する薬剤について検討を目的としている。昨年までに、AAV表面抗原と感染細胞のAAV受容体の結合のモデリング解析から、AAVの細胞への結合を変化させる候補capsidのデザインを終えている。本年度は、様々な細胞株を用いた感染効率の比較検討を行った。その中で、視細胞のモデル株としても使用されているY79細胞に対し、感染効率が高いconstructを発見した。このconstructは、使用した他の細胞株では導入効率が低いにも関わらず、Y79で顕著に高い感染効率を示した。この結果から、視細胞選択性が期待される。今後は動物実験あるいは組織培養において、発現効率を既存のAAVと比較し検討する予定である。組織培養については、本年度、培養後の網膜崩壊日数について検討を行った。次年度は、この方法を改変し、遺伝子導入効率を検討する材料として使用し解析すると共に、安定的な発現解析用組織培養の確立を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までに、硝子体投与時に内境界膜においてトラップされず、また、網膜内部までAAVを到達させるために、AAV結合サイトのモデリングを行い、AAVの細胞への結合を変化させる候補capsidをデザインした。具体的には、AAV表面抗原と感染細胞におけるAAV受容体の結合のモデリング解析を行った。
本年度は、モデリングにより得られたconstructionを遺伝子改変により作製し、AAV精製を行った。このAAVを用い、様々な細胞株を用いた感染効率の比較検討を行った。その中で、視細胞のモデル株としても使用されているY79細胞に対し、感染効率が高いconstructを発見した。このconstructは、使用した他の細胞株では導入効率が低いにも関わらず、Y79で顕著に高い感染効率を示した。Y79をはじめ、視細胞様とされている細胞がいくつか存在するが、視細胞への遺伝子導入を確認するためには、未だ動物実験による確認が必要である。本年は、実験動物を使用せず解析するために、食肉加工場から豚眼を入手し、培養可能な条件および網膜崩壊日数について検討を行った。今後はこの組織培養を用い、construct及び透過性を向上させる試薬の検討を行う予定である。
我々は既に、植物由来酵素がAAVの血清型に依らず、細胞への遺伝子導入効率を改善することを確認しているが、この薬剤の効果についても実験動物ではなく、本年度検討した組織培養を使用することで、多くを解析できると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
Y79細胞に対し感染効率が高いconstructを含め、感染効率の向上が見られたconstruct数種について、網膜を用いて、遺伝子導入効率および選択性を調べる。しかし、動物愛護の観点から極力、実験動物の使用を避けた解析を心掛けたい。そのため、本年度行った食肉加工場から入手した検体眼球を用いた組織培養を行い、解析を進めたい。しかしながら、凡その網膜培養可能日数と網膜崩壊性を調べているが、採取時・採取後の状況が異なるためか、安定した結果を得られていない。培養条件においても改善が必要とも考えられる。このような状況下においても、網膜組織培養は、個体数を増やすことで、解析可能ではある。次年度は、より安定した組織培養の条件検討と遺伝子発現解析を行う。一方で確実な方法として、限られた実験動物個体で遺伝子発現を調べたい。
また、我々は既に植物由来酵素がAAVの血清型に依らず、細胞への遺伝子導入効率を改善することを確認しているが、前年の研究により遺伝子導入改善をもたらす濃度において、30時間暴露で細胞毒性を示した。このことから、眼内においては遺伝子導入効率改善として使用するには難しい可能性がある。しかし、低濃度において、内境界膜等に与える影響および副次的にAAV導入効率を改善する可能性を考え、網膜組織培養を使用し、植物由来酵素濃度と内境界膜に与える影響およびAAV感染について調べたいと考えている。
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