| Project/Area Number |
22K09768
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56060:Ophthalmology-related
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
井上 みゆき 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 医学教育部研究員 (20631766)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 俊洋 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (00317025)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 緑内障 / TGF-β / 結膜線維芽細胞 / 線維柱帯細胞 / 線維化 / TGF-β2 |
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| Outline of Research at the Start |
緑内障は失明原因の上位を占められていることが既に報告されている。緑内障の要因の一つである眼圧上昇は網膜視神経節細胞死を誘導し、その結果失明に至る。この眼圧上昇には房水中のTGF-β2やサイトカインが関与し、房水流出に関わる細胞の機能を変化させることで房水流出を妨げ、さらには緑内障手術の治療成績にも影響を与え、緑内障病態を悪化させていると考えられている。我々はこの細胞の機能変化はTGF-β2等による遺伝子発現を制御するエピゲノム変化に寄るものではないかと考え、緑内障病態におけるエピゲノム変化を調べることにより緑内障治療および新規薬剤開発へ貢献することが出来るのではないかと考え、本研究を実施する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
緑内障は失明原因の上位であり、日本においても有病率は40歳以上で5％と高値であることが報告されている。治療としては点眼薬にて眼圧上昇を抑えることであるが、点眼薬によって眼圧上昇が抑えられない場合には手術によって流出路を形成し、房水流出を増加させ、眼圧を下げる治療を選択することとなる。緑内障患者房水中に多く含まれているTGF-β2やサイトカインは、房水流出調節に関わる線維柱帯細胞やシュレム管内皮細胞を線維化様に促進させ、その結果として房水流出を妨げる。さらに緑内障手術においては結膜線維芽細胞の瘢痕化にも影響を及ぼし、治療成績を悪化させる。現在までエピゲノムの変化が細胞増殖、分化、癌、老化、線維化に関与していることが数多く報告され、エピゲノム変化に伴う遺伝子発現制御に伴う細胞内代謝の変化が鍵を握っていることが明らかにされつつある。緑内障病態においては細胞の機能変化にDNAメチル化やヒストンのメチル化・アセチル化といったエピゲノムの変化が関与しているかは明らかではなく、特にそれに伴う細胞内代謝における遺伝子制御については未だ不明な点が多い。
現在まで申請者は、緑内障と関連しているTGF-β2に着目し、線維柱帯細胞や緑内障手術成績に関わる結膜線維芽細胞を用い、TGF-β2による細胞の線維化について研究を行ってきている。これまでTGF-β2による線維柱帯細胞や結膜線維芽細胞の線維化がヒストン脱メチル化酵素であるLSD1の阻害剤によって抑制されること、さらに代謝関連遺伝子発現も関与していることが明らかとなり、現在この制御機構について検討している。本研究は基礎的研究観点から、緑内障病態と細胞内におけるエピゲノムの変化、またそれに伴う細胞内代謝に関わる遺伝子制御機構との関連性を探り、新しい知見が今後の緑内障治療および新規薬剤開発へ貢献することを目的とし実施することとする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの緑内障病態関連の研究においては、TGF-βシグナルの活性化が房水流出を抑制すること、線維柱帯細胞においては細胞外マトリックスの産生増加や下流シグナルの活性化を導き線維化様の変化を誘導し、房水流出の機能を妨げていることが示唆されており、申請者も同様に研究結果を導いてきた。本研究ではヒト結膜線維芽細胞、線維柱帯細胞において、TGF-β2刺激によって発現上昇する細胞外マトリックスであるコラーゲンおよびα-SMA等の線維化に関わる遺伝子発現にエピゲノムに関わる因子が関係しているかどうかを調べることとした。まず初めに熊本大学眼科学講座の研究グループより網膜神経節細胞死を抑制する効果があることをすでに報告されているヒストン脱メチル化酵素であるLSD1の阻害剤に着目し、LSD1阻害剤の線維化に関わる遺伝子発現に対する効果について検討した。ヒト結膜線維芽細胞の培養条件について検討した後、コントロール群、TGF-β2刺激群、TGF-β2刺激とLSD１阻害剤群において、線維化に関わる遺伝子発現をWestern blot法やreal-time RT-PCR法を用いて調べた。さらにLSD1を阻害した場合の検討については、阻害剤だけでなくsiRNA技術を用いて検討を行った。その結果、TGF-β2刺激によって産生促進されるコラーゲンType I、α-SMAの発現、下流転写因子Smad3のリン酸化はLSD1阻害によって抑制された。さらにTGF-β2刺激によって解糖系代謝経路に関わる遺伝子、GLUT1、LDHAの発現も促進されており、その効果に対してLSD1阻害剤による抑制効果が確認された。これまで他の臓器の細胞において、TGF-βによる線維化促進に関わっているセリン-グリシン合成経路の制御についてもヒト結膜線維芽細胞および線維柱帯細胞において関与しているかどうかを現在解析している最中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までヒト結膜線維芽細胞および線維柱帯細胞においてもTGF-β2による線維化に関与する遺伝子発現上昇に対して、ヒストン脱メチル化酵素であるLSD1阻害の抑制効果について明らかになってきた。一方、肺の線維芽細胞の線維化においては、TGF-βシグナル活性化によってセリン-グリシン合成経路に関わる遺伝子群の発現が上昇し、その結果コラーゲンの産生を促進させ線維化を生じさせていることが報告されている。ヒト結膜線維芽細胞および線維柱帯細胞において、TGF-β2による線維化にセリン-グリシン合成経路が関わっているかは未だ明らかではない。そこで、本研究においてヒト結膜線維芽細胞においてTGF-β2によってセリンーグリシン合成経路に関わる遺伝子群が発現変動しているかどうかを過去に論文で報告されたマイクロアレイ解析結果から調べることにした。その結果、特に二つの合成酵素がTGF-β2によって発現上昇していることが明らかになった。これまで報告されている肺の線維芽細胞とは違い、発現変動するセリンーグリシン合成経路に関わる遺伝子が限られているので、さらに関与する遺伝子については詳細に調べていきたいと考えている。また同時に発現変動が見られた遺伝子に対するLSD1阻害の効果についても検討し、ヒト結膜線維芽細胞においてセリン-グリシン合成経路を介した線維化を抑制出来るかどうかについても検討する予定である。
さらに次世代シーケンサーを用いてRNAシーケンス解析を用い、LSD1阻害によって変動する遺伝子群についても網羅的に調べる。ヒト結膜線維芽細胞、線維柱帯細胞において線維化を促進または抑制する遺伝子群を見出し、エピジェネティクスな変化が線維化にどのように影響を与えているのかを調べることとする。
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