| Project/Area Number |
22K09902
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57010:Oral biological science-related
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
青山 絵理子 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (10432650)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (20112063)
久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (90221936)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | S-adenosylmethionine / polyamine / S-アデノシルメチオニン / 軟骨細胞 / 細胞外基質 / ポリアミン / DFMO / MAT2A / droplet / chondrocyte / LLPS / cartilage |
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| Outline of Research at the Start |
SAMは関節炎に有効であることが示唆されているが、その作用機序は解明されていない。本研究では、SAMがポリアミン合成の材料源となるのみならず、ポリアミン合成の律速酵素ODCを誘 導してポリアミン合成を促進し、その結果として軟骨基質合成が亢進することを明らかにすること、およびその過程に軟骨再生因子CCN2の遺伝子発現誘導が関与しているのか否か、を解明する。さらにポリアミンの軟骨基質産生の制御機序について近年注目されている液-液相分離に注目して基質関連遺伝子の発現制御機構を明らかにすることでSAMの軟骨細胞に対する作用とその分子機序の全貌を解明し、SAMの臨床応用へ向けての分子基盤の確立を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
S-adenosylmethionine(SAM)が軟骨分化過程におけるSAMの作用について解析するため、間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞をITS存在下で4週間培養し、1週ごとに石灰化基質を染色するアリザリンレッド染色と遺伝子発現の解析を行った。その結果、この培養系では脂肪細胞様の形態を持つ細胞が見られ、この脂肪様細胞はSAM存在下でさらに増加した。この時、SAMにより脂肪マーカーであるPPARgammaの発現が有意に上昇した。その一方で、石灰化の指標であるアリザリンレッド染色および分化培養3週目のアルカリフォスファターゼの遺伝子発現はSAM存在下でやや優性であったものの有意ではなかった。このことはSAMが培養条件によっては間葉系幹細胞の脂肪細胞分化を促進することを示していると同時に、今回採用した培養系が本来の目的である軟骨分化に最適ではない可能性が高いと言える。そこでBMP2による軟骨誘導あるいはマイクロマス培養法による軟骨分化誘導法に切り換えてさらに検討中である。
また、SAMによる軟骨基質合成促進について遺伝子発現とSAMによるポリアミン合成経路の促進との関連があることについては既に報告したが、これらの両者の繋がりについては十分には明らかにできていなかった。この点を明らかにするため、スペルミンおよびスペルミジンを染色するポリアミンレッドで染色した時に細胞内の液滴が存在することを確認することができた。そこで研究分担者である久保田教授が導入した微小環境への光照射システムを用いた光単離化学法によってこの液適中のトランスクリプトーム解析計画が進行中である。
さらに軟骨細胞分化過程における内在性のSAMの濃度変化について明らかにすることを計画し、SAMを認識するRNAアプタマーを発現させた細胞をライブセルイメージングシステムを用いて解析するための条件検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和6年度に研究を補助する予定だった研究員が諸事情によりラボを離れることになったことや計画当初にはまだ開発されていなかった新技術を用いた実験を加える必要が生じたことにより新たな実験系を確立することに予想外に手間取ったため、予定していたよりも進捗に遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は間葉系幹細胞株であるC3H10T1/2細胞を用いて軟骨細胞の分化と内軟骨性骨化に至るまでの過程にSAMがどのような働きをするかを明らかにするため、BMP2による軟骨誘導あるいはマイクロマス培養法による軟骨分化誘導法に切り換えるなど適切な骨化までの最終分化を確認できる分化培養系を確立する。
また、SAMによる軟骨基質合成促進について遺伝子発現とSAMによるポリアミン合成経路の促進とのの両者の繋がりについて明らかにするため、研究分担者である久保田教授が導入した微小環境への光照射システムを用いた光単離化学法によってポリアミン液適中のトランスクリプトーム解析を進める。
さらに近年、Dey S. K.のグループによりRNAアプタマーを利用して細胞内のSAM濃度をリアルタイムに蛍光顕微鏡観察し、測定できる実験方法が開発された(Nat Chem Biol . 2022)。この方法を用いて軟骨細胞分化過程における内在性のSAMの濃度変化について明らかにすることを計画し、RNAアプタマーの発現ベクターを入手した。これを軟骨細胞分化培養系で発現し、ライブセルイメージングシステムを用いて解析するための条件検討を行っている。これにより軟骨細胞分化過程における内在性のSAMの増減について時間的空間的な知見を得ることが期待できる。
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