頭頸部扁平上皮癌の神経周囲浸潤：ゲノム編集を用いた腫瘍生物学的解析

Research Project

Project/Area Number	22K09934
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 57020:Oral pathobiological science-related
Research Institution	Kanagawa Dental College
Principal Investigator	倉田俊一神奈川歯科大学, 歯学部, 特任教授 (60140901)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	加藤伊陽子神奈川歯科大学, 歯学部, 特任教授 (20333297)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	頭頸部扁平上皮癌 / p63 / 浸潤 / 神経 / 神経周囲浸潤 / TP63
Outline of Research at the Start	神経周囲浸潤（Perinuclear invasion, PNI）は口腔、咽頭、喉頭などの頭頸部癌で高頻度に見られ、頸部リンパ節転移の前段階とされるが、その分子機構は明らかにされていない。本研究は頭頸部癌に由来する培養細胞株を用いて、PNIを起こす分子機構の解明とそのマーカーとなる分子の検索を目的として実施する。具体的には、新しいバイオアッセイ系を作成し、ゲノム編集やRNA干渉技術と組み合わせて、特定の遺伝子発現とPNI活性の関連を解析する。
Outline of Annual Research Achievements	令和４年度(2022年度)は頭頸部扁平上皮癌由来細胞株からゲノム編集によって作ったp63ノックアウト細胞に関して、遺伝子発現の解析を行うとともに、マトリゲルフィルターによる神経周囲浸潤(PNI)のアッセイ系の構築に向けて実験を進めた。成果を以下に要約する。 (1) ゲノム編集細胞としてはすでに中咽頭扁平上皮癌由来FaDu細胞株からCRISPR-Cas9法で構築したTP63遺伝子のノックアウト細胞株で、TP63発現全体が停止することが確認されたので、本研究でPNI活性を親細胞と比較する実験に用いることとした。 (2) 遺伝子発現のマイクロアレイ解析を行ったところ、ノックアウト細胞は上皮間葉転換（EMT）を示す明確な変化を示した。加えて NEFL, NCAM1、NRCAM、NEUROD2、SEMA3D/4G/5Bほか神経発生と関連する遺伝子発現の大幅な上昇が検出された。その一部についてRT-qPCRとウエスタンブロットで確認を進めた。 (3) 神経周辺浸潤（PNI）活性のアッセイ系を構築するために、まず一般的な浸潤アッセイとしてMatrigelチャンバーを用いて、血清を誘因剤として下層に移動する細胞を測定した。浸潤効率はノックアウト細胞で親細胞の2倍に上昇していた。癌組織は不均一な細胞集団であるが、TP63発現が低下してEMTを示す細胞は集団的な浸潤を先導することが最近報告され、その観察と一致している。さらに誘因細胞としてシュワン細胞に由来する細胞株を用いる浸潤アッセイの条件を検討した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 高分化型扁平上皮癌細胞からエピゲノム調節により分化を誘導する遺伝子をノックアウトし、上皮間葉転換(EMT)が起こったとみなされる細胞を構築できた。一般的な浸潤アッセイでEMT細胞が効率よく浸潤することを確認し、神経周辺浸潤（PNI）のアッセイ系に向けて基盤ができた。ただ、EMTと浸潤は深く関連するものの、細胞接着を失ったEMT細胞そのものが浸潤癌の本体になるとは限らない。本課題では神経系細胞への指向性がどのような因子や遺伝子発現で得られるのかについて今後明らかにする。
Strategy for Future Research Activity	令和５年度：　（１）PNIアッセイ系で誘因細胞（神経系細胞株）および被検細胞（扁平上皮癌由来細胞株）として使用する細胞の検討し、培養条件等の改良を行う。すでにシュワン細胞の性質を持つ腫瘍由来の細胞株を培養しており、扁平上皮癌の浸潤を誘導するかどうかを検討する。さらに、初代培養（ラット・脊髄後根ガングリオン）を試す。一方、被検細胞としては別の分化型扁平上皮癌、上記p63ノックアウトによる上皮間葉転換細胞株、浸潤癌由来の細胞など、浸潤能を異にする細胞を用いて検討を行う。（研究代表者）（２）神経への指向性を決定する遺伝子を検索する。上記の頭頸部癌由来の細胞で、マイクロアレイまたは（および）RT-qPCRによって、神経指向性の受容体や接着因子の遺伝子発現パターンを調べ、PNIアッセイの結果と対応させる。（研究分担者）令和６年度：　（１）培地に血清濃度や調節因子の添加を試み、より効率的なPNIが得られる条件を決定する。誘因側の神経関連細胞と浸潤する側の扁平上皮癌細胞にsiRNAをトランスフェクトし、特定遺伝子のノックダウンを行い、PNI誘導に必須の遺伝子を検索する。またp63を失うと細胞骨格や接着分子の発現が大きく変化するので、蛍光抗体法により細胞の形態変化を観察する。（研究代表者）（２）種々の細胞株の遺伝子発現とPNI活性の関連づけ、PNI誘導に寄与する遺伝子を推測し、ノックダウン実験に供する。誘因操作によるmRNAとタンパク質の変化を解析する。（研究分担者）