| Project/Area Number |
22K09952
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57020:Oral pathobiological science-related
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
西川 清 愛知学院大学, 歯学部, 講師 (50340146)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | ポルフィロモナス・ジンジバリス / FimSセンサータンパク質 / ランダム変異導入 / 接合伝達 / アミノ酸置換 / FimA線毛 / 環境シグナル / 遺伝子相補 / 発現ベクター / 変異導入 / 菌株ライブラリー / 2成分制御系 / AtoC / 歯周病原細菌 / 線毛消失 / 2成分制御系センサー / 3次元機能マッピング |
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| Outline of Research at the Start |
歯周病は口腔細菌ポルフィロモナス・ジンジバリス（Pg菌）が菌体表層の線毛を介して歯肉溝に定着し、他菌種も巻き込んだ病的なプラークを形成することで成立する。Pg菌の線毛産生量は2成分制御系と呼ばれる環境変化感知システムにより制御されており、そのセンサーの働きを阻害すればPg菌の病原性を大幅に減弱できる。本研究では、Pg菌の臨床分離株や人工的な変異導入で得た菌株集団の中から、センサー内の単一アミノ酸置換が原因で線毛が消失した株を分離同定し、変異アミノ酸の位置を立体構造モデルに投影した3次元機能地図の作成を目的とする。研究成果は新しい歯周病治療薬の設計やPg菌が感知する環境シグナルの同定に役立つ。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、歯周病原細菌 ポルフィロモナス・ジンジバリス（Pg菌）の重要な病原因子であるFimA線毛の発現を転写レベルで調節する2成分制御系センサーFimSの構造に焦点を当て、そのセンサードメイン遺伝子領域へランダムに変異導入した菌株ライブラリーの作製と表現型解析により、線毛発現量に変動を来し未知の環境シグナル受容に必須と考えられるアミノ酸残基の置換部位を網羅的に同定することである。
2年目となる令和5年度は、ランダムに変異導入されたfimS遺伝子を発現ベクターpTCBexに組込み、Pg菌のfimS破壊株AGFS1に効率よく導入してライブラリー化するためのプロトコル確立に注力した。エラープローンPCR法により変異導入されたfimS遺伝子をinverse PCR法でpTCBexに組換えた後、接合伝達法でPg菌AGFS1株に導入したところ、1回の実験で500株以上の独立したfimS遺伝子相補株が得られた。接合伝達における2菌種の混合培養後のPg菌選択培養も、ゲンタマイシンとテトラサイクリンの併用で大腸菌増殖を完全に抑制できた。
一方、発現ベクターを直接電気穿孔法でAGFS1に導入する方法では形質転換株の収量が安定せず、最高でも100株程度、悪いときは０株で、数回の実験を繰り返した挙句130株程度しかfimS相補株が得られなかった。この結果を受け、Pg菌遺伝子相補株ライブラリー作製には専ら大腸菌を介した接合伝達法を適用することとし、漸く実験方法が確立した。
得られたfimS相補株を対象に、センサー内変異部位の特定とアミノ酸置換状況の解析、並びにFimA線毛の発現レベル解析を進めた結果、環境シグナル受容に必須と推定されるアミノ酸残基が複数特定できた。これらの研究成果は複数の国内学会で口頭発表後、論文に纏めてオープンアクセス英文専門誌へ投稿した（令和6年4月上旬に掲載受理）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
FimSセンサードメイン内アミノ酸置換株の同定と線毛表現型解析の進捗が予定よりも遅れており、当初目標としていた全構成アミノ酸に及ぶ網羅的な解析データ取得にはまだ道半ばの状況である。その理由として３つ挙げられる。
①ランダム変異導入株構築のための実験方法の確立に予想以上の時間を要した。
②現在使用中の変異導入株ライブラリーにおける実際の変異導入効率が、予備実験データから想定していたものよりも低く、全長シーケンス解析後に「変異導入無し」と判明した株が全体の5割を超える状況であった。
③令和５年度中に得られた最大の研究成果は「Pg菌におけるランダム変異株ライブラリー作製方法の確立とFimSセンサードメインの構造ー機能相関解析への応用例提示」であり、これを主題とした英語論文（大学院生の学位申請基盤論文を兼ねる）の作成と学術雑誌への投稿作業、及び複数の査読者との議論に年度の後半の大部分を費やすことになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
FimSセンサードメイン内にランダム変異を導入するエラープローンPCR反応の段階で、反応液の組成を工夫することにより、これまで解析に用いてきたfimS変異株ライブラリーと比べ約2倍の高い頻度で変異が導入されたPCR産物を既に得ている。
本年度はこれを出発材料に用いた新規のfimS変異株ライブラリーを追加作製し、FimSセンサー内アミノ酸置換株の同定と、それらのFimA線毛発現変動解析を遂行する。これによりアミノ酸置換株同定の効率化・解析速度向上が期待できる。
また、これまではFimA/fimAの発現レベルが親株よりも減少もしくは消失した株のみを念頭に置きスクリーニングを進めてきたが、研究の進展に伴い、逆に線毛発現量の増加を示す変異株の存在も明らかとなった。これは予想外であったが、未知の環境シグナル・リガンドとの親和性が過剰になった結果と解釈でき、そのような株でアミノ酸置換が生じた部位も、線毛減少・消失株と同様シグナル受容に直接関わる重要なアミノ酸残基と考えられる。よって今後はこれらを含め、線毛発現量に正または負の変動を来したfimS変異導入株すべてを対象とし、アミノ酸置換状況との関連を解析する。
残された時間的には厳しいものがあるが、「FimSセンサードメインを構成する300個以上のアミノ酸残基それぞれについて、未知の環境シグナルとの直接的相互作用を介したFimA線毛産生への貢献度を定量化する」という、当初の網羅的な解析目標に可能な限り近づけられるよう鋭意努力する。
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