侵襲性歯周炎の原因遺伝子NOD2変異型の機能解析

• Project/Area Number: 22K09996
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 57030:Conservative dentistry-related
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 永田 有希 東京医科歯科大学, 統合研究機構, 助教 (50405841)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 須藤 毅顕 東京医科歯科大学, 統合教育機構, 特任講師 (10821168) ; 田中 敏博 東京医科歯科大学, 統合研究機構, 教授 (50292850)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000); Fiscal Year 2022: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
• Keywords: 侵襲性歯周炎 / 免疫応答 / NOD2 / 口腔内細菌

Outline of Research at the Start

侵襲性歯周炎は、若年期から発症・劇症化し、一般的な予防法、治療法が奏功しにくい疾患である。一部の患者は家族内発症することから原因遺伝子の探索が行われ、2017年に本研究の共同研究者らによって原因遺伝子のひとつがNOD2であることが示された。
NOD2は自然免疫応答因子であり、自己炎症性疾患の原因遺伝子としても知られている。また、免疫応答の亢進や破骨細胞の骨吸収活性の上昇などにも関与していることから、本研究では侵襲性歯周炎患者特異的に発見された5種類のNOD2変異型について詳細な機能解析を行い、これまで知られていなかった侵襲性歯周炎の発症メカニズムを解明し、新しい予防法と治療法の確立に貢献する。

Outline of Annual Research Achievements

侵襲性歯周炎の原因遺伝子NOD2の5種類の変異型を293T細胞に導入し、細菌の構成因子であるlipopolysaccharide (LPS)、muramyl dipeptide (MDP)、慢性歯周炎の原因菌として知られるP. gingivalis (P.g.) および侵襲性歯周炎患者で高頻度に観察されるA. actinomycetemcomitans (A.a.) の細胞破砕液に対する免疫応答を確認した。
その結果、MDPとP.g.菌、A.a.菌破砕液に対して何種類かのNOD2変異型で免疫応答の亢進が観察された。
NOD2変異型の変異の位置が、すべてNOD2ホモダイマー、NOD2の結合パートナーであるRIP2Kとのヘテロダイマーおよび、リガンドであるMDPとの結合ドメイン上にあることから、NOD2変異型による免疫亢進がNOD2結合パートナータンパク質との親和性の変化によるものではないかと考え、Native-pageおよびBlue Native-page法によるダイマー/ポリマー解析に着手した。変異型によるダイマー/ポリマー形成頻度に違いがありそうな所見を得られてはいるものの、説得力のあるデータを取得できていない。そこでドライ解析の専門家に相談しながら、AIによる結合親和性予測アルゴリズムの使用を試みている。
また、免疫細胞を用いた実験を行うため、ゲノム編集による変異型の取得に着手している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでNOD2過剰発現細胞株の取得を試みていたが、免疫細胞におけるNOD2の過剰発現が細胞死を招く傾向がみられ、進捗が遅れていた。そのため、これまでトライしてきたレンチウイルスを用いた過剰発現系からlow copy promoterによるNOD2発現系の構築と、ゲノム編集による変異導入へと方針を変更した。
現状ではやや遅れているものの、low copy promoterとして知られるUBCを用いたNOD2変異型発現細胞をTHP-1を用いて構築中であり、一部の変異型の取得に成功した。ゲノム編集については試薬類を購入し、現在条件検討中である。Control kitを使用した検証の結果、THP-1細胞株では2割程度の成功率で変異導入株を取得できそうな結果を得ている。

Strategy for Future Research Activity

NOD2変異型の結合パートナーとの親和性の変化を明らかにするため、ウェットとドライの両方向からの解析を進めていく。ウェットでは、NOD2変異型を導入した細胞のWhole cell lysateおよびNOD2抗体で免疫沈降したサンプルを用いてNative-PageおよびBlue Native-Pageを実施していく。ドライ解析は専門家に相談中であるが、ウェブベースでも実施可能なアルゴリズムがいくつかあるので複数のアルゴリズムによる検証を進めていきたい。
これまでの実験結果から、免疫細胞におけるNOD2の過剰発現が細胞死をもたらしている可能性が示唆されているため、NOD2変異型による細胞死やアポトーシスへの関与についても検証していく。NOD2がアポトーシスに関与している可能性を示唆する論文と、否定する論文が複数報告されているため、本研究でもNOD2のアポトーシス制御の可能性と、変異型によるアポトーシス誘導活性の有無や変化について検証していきたい。
また、免疫細胞におけるNOD2変異型のゲノム編集が成功次第、マクロファージおよび破骨細胞への分化能と活性についての検証も進めていく。