| Project/Area Number |
22K10032
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
池田 正明 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 非常勤講師 (20193211)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丸川 恵理子 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (40419263)
池田 やよい 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (00202903)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 骨再生 / 軟骨内骨化 / 間葉系幹細胞 / 脂肪幹細胞 / 軟骨細胞 / 足場材料 / ヒアルロン酸 / コラーゲン / 再生 / 骨 / 生体材料 / 炎症 / 低酸素 |
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| Outline of Research at the Start |
従来の生体材料や幹細胞を用いた骨再生療法は、大型の骨欠損に適用するには限界がある。その要因の一つは骨欠損部の血流不足である。骨折の治癒過程においては、血管新生と軟骨内骨化が重要な役割を担っている。本研究は、炎症の賦活化と低酸素環境によって血管新生と軟骨内骨化を誘導する生体材料(物質)を明らかにすることを目的とする。本研究の成果は、従来法の重大な問題点とされる血流不足の改善に大きく貢献する可能性があり、自家骨移植に近い画期的な骨再生療法の開発に繋がると期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
従来の生体材料および幹細胞を用いた骨再生療法においては、大型の骨欠損への適応に限界がある。その要因の一つは骨欠損部での血流不足である。生体が本来もつ骨折の治癒過程においては、血管新生と軟骨形成（仮骨形成）、およびそれに続く軟骨内骨化が重要な役割を担っている。骨折治癒過程、特に血管新生と軟骨形成を再現させる骨再生法の開発は、従来法の問題点を大きく改善できる可能性がある。最近、無菌性の自然免疫応答（炎症）や低酸素状態を誘導する生体材料が、血管新生、幹細胞の浸潤および軟骨形成に寄与し、骨や心筋の再生を促進することが報告された。以上の知見をもとに予備実験をおこなった結果、研究者らは、生体吸収性や生体親和性に問題が残るものの、骨折の治癒過程を再現するのに有効と思われる生体材料を見出した。そこで本研究は、血管新生と軟骨形成を誘導できる生体吸収性や生体親和性に優れた生体材料を明らかにし、軟骨内骨化を介した新しい骨再生療法の開発に貢献することを目的とする。
現在までに得られている結果および経過は以下の通りである。骨欠損の再生に非常に有効な生体吸収性や生体親和性に優れた複数の抗酸化剤および炎症賦活剤を発見した。さらに再生過程で軟骨の形成は認められなかったため、当初想定していた軟骨内骨化ではなく膜内骨化によって骨の再生が起こったと推定された。したがって、抗酸化剤および炎症賦活剤を含む足場材料として、軟骨分化に適した細胞外基質であるヒアルロン酸ゲルを用いる必要がないため、場材料としてすでに医療用として市販されているコラーゲン製品を使用することにした。さらに抗酸化剤を足場材料（コラーゲン）に浸透させるだけでは十分ではなく、化学的に足場材料内と結合させ、欠損部に長く止まらせる必要があることが判明したため、抗酸化剤とコラーゲンの結合条件の検討をおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和4、5年度は、骨折の治癒過程を再現するのに有効と思われる生体材料を用いて、骨折初期過程の再現と軟骨内骨化の検討をおこなった。その結果、当初の計画で用いた抗酸化剤(低酸素状態を惹起)と免疫賦活剤(炎症の賦活)に代わって、生体吸収性や生体親和性に優れた複数の抗酸化剤（A1ーA4）および炎症賦活剤（B）が骨欠損の再生に非常に有効であることを発見した（未発表データ）。4週齢のマウスの頭蓋冠骨に直径3 mmの骨欠損を作成し、A （A1ーA4のうちのいずれか１つ）とBを含む足場材料（コラーゲン）を移植した。マイクロCTによる解析の結果、４週後には骨欠損部の30％-90％に石灰化が認められた。一方、生理食塩水を含む足場材料を移植した群では石灰化は全く認められなかった。
組織学的解析の結果、軟骨の形成は認められなかったため、当初想定していた軟骨内骨化ではなく膜内骨化によって骨の再生が起こったと推定された。したがって、抗酸化剤および炎症賦活剤を含む足場材料として、軟骨分化に適した細胞外基質であるヒアルロン酸ゲルを用いる必要がないため、足場材料としてすでに医療用として市販されているコラーゲン製品を使用することにした。
効率的な骨再生を検討した結果、抗酸化剤を足場材料（コラーゲン）に浸透させるだけでなく、化学的に結合させ足場材料内に長く止まらせる必要があることが判明したため、抗酸化剤とコラーゲンの結合条件の検討をおこなった。さらにより骨再生が困難な条件でも再生が起きることを示すため、移植するマウスを4週齢からより加齢の進んだ8週齢に変更し、さらに骨欠損の大きさも直径3 mmから4 mmに拡大して移植実験をおこなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度は、前年度までに見出した生体吸収性・生体親和性の高い抗酸化剤（A1ーA4）と炎症賦活剤（B）を用いてマウス頭蓋冠骨欠損部に移植する動物実験を継続し、骨再生にとって最適な条件をさらに検討する。
それとともに骨再生のメカニズムの解析をおこなう。移植後0-4週間のμ-CTによる経時的な石灰化解析の後、移植組織を脱灰し、組織学的解析および免疫組織学的解析 (HIF-1α、CD31、コラーゲンなど)をおこなう。それに加えて、移植3-7日後に移植部位を摘出し、炎症性細胞や未分化幹細胞などの細胞浸潤、低酸素プローブを用いた低酸素状態、および血管新生を解析するとともに、定量 RT-PCR 法を用いて骨分化マーカーの発現を解析する。以上の解析を通じて、炎症の賦活化と低酸素環境によって炎症性細胞や未分化幹細胞などの細胞浸潤および血管新生が起こり、骨化を誘導することを明らかにする。
当初の計画では、大きな骨欠損に対するこの方法の有効性を調べるため、大型実験動物（ラット・ウサギ・犬）を用いた検討をおこなう予定であった。しかしながら、本研究の完成と論文発表を優先することとし、そのため上記の実験に集中することにした。したがって、大型動物を用いた実験は、今後改めて申請する新たな研究課題でおこなう予定である。
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