Snailが口腔がん細胞のpartial EMTとEMTを分別して支配する機構

Research Project

Project/Area Number	22K10171
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 57060:Surgical dentistry-related
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	飛梅圭広島大学, 医系科学研究科(歯), 准教授 (40350037)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Keywords	complete EMT / partial EMT / SCC / EMT / Snail / pEMT / NGS
Outline of Research at the Start	Snailを導入した大多数のOM-1細胞は上皮と間葉の形質を併せ持ったpartial EMT形質を保持するため、partial EMTをEMTへシフトさせる培養条件、および、EMTを上皮形質へシフトさせる培養条件をそれぞれ確立してきた。本研究では、この実験系を用い、新規にpartial EMT-EMTの往来に呼応して発現ON/OFFを受けるSnail標的遺伝子群を同定する。また、それらSnail標的遺伝子の発現ON/OFFを制御するエピジェネティック機構を解明し、段階的かつ可逆的な上皮間葉転換機構をSnailが支配する全貌を解明する。
Outline of Annual Research Achievements	NGS解析でSnai1が誘導するpartial EMTとEMTで発現プロファイルが一致する遺伝子、どちらかに特異的な発現を示す遺伝子群を抽出することで、なぜ、同じ転写因子Snailを発現するOM-1の遺伝子発現プロファイルが変化しpartial EMTとEMTが段階的に制御できるのか、個々の標的遺伝子の機能を俯瞰的にとらえ、その統合される生理機構を以下の2点で明らかにすべく研究を行っている。。１．partial EMTとEMTでSnailが結合するゲノム上のサイト分布が変化するか？２．partial EMTとEMTでSnailは発現調節領域への結合を変えず、Snailの形成する転写因子複合体の構成変化により、近辺のクロマチン構造、具体的にはヒストンの修飾が変化するか？本年度は、合成糖質コルチコイドがOVOl遺伝子の発現を誘導しEMTをpartial EMTへ巻き戻すことを発見した。さらに異所性のステロイド合成経路が核内受容体の共存下でSnail遺伝子の支配下partial EMTとEMTを分離することを発見した。また合成糖質コルチコイドにはOVOLファミリー遺伝子が応答することが判明し、partial EMT維持に異所性のステロイド合成がSnail標的遺伝子の選択性を制御している可能性が判明した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 同一の遺伝的バックグラウンドを保持する口腔扁平上皮から重層化能保持、partial EMT、EMT形質を保持するサブクローンを用いた解析を行っている。特筆する実績として合成糖質コルチコイドへの応答がSnail依存性のpartial EMTとEMTを分別することを発見できた。この結果、partial EMTとEMTでSnailは発現調節領域への結合を変えず、Snailの形成する転写因子複合体の構成変化により、近辺のクロマチン構造、具体的にはヒストンの修飾が変化する可能性を検証している。すなわち、コルチコイドシグナルがpartial EMTとEMTで特定の染色体領域で近接したSnail応答遺伝子群の一様あるいは相反した発現ON/OFFを示すことでpartial EMTとEMTを分別する実態を目視、実証する段階に研究は進展している。
Strategy for Future Research Activity	NGS解析でSnai1が誘導するpartial EMTとEMTで発現プロファイルが一致する遺伝子、どちらかに特異的な発現を示す遺伝子群を抽出することで、なぜ、同じ転写因子Snailを発現するOM-1の遺伝子発現プロファイルが変化しpartial EMTとEMTが段階的に制御できるのか、個々の標的遺伝子の機能を俯瞰的にとらえ、その統合される生理機構を以下の2点で明らかにしたい。１．partial EMTとEMTでSnailが結合するゲノム上のサイト分布が変化するか？この可能性を検討するために、pEMT OM-1Snai1とEMT OM-1Snai1細胞をそれぞれ抗Snail抗体を用いたChIP-seq解析に供し、全ゲノム配列上でのSnail結合サイトを網羅一覧する。解析結果はNGSデータとして得られるため,ゲノム上に結合サイトをマッピングすることで両細胞間でのSnail結合配列の分布の違いが定量的に明確になる。２．partial EMTとEMTでSnailは発現調節領域への結合を変えず、Snailの形成する転写因子複合体の構成変化により、近辺のクロマチン構造、具体的にはヒストンの修飾が変化するのか？この可能性を迅速かつ強力に検討するためにATAC-seqを用い、まず全ゲノム上のクロマチンアクセス可能サイトを網羅一覧し定量的に両細胞間でのクロマチン構造が異なるゲノム領域を同定する。さらに1で得るChIP-seqと既に得ているRNA-seqをゲノム上に同時にマッピングして一覧することで、Snailの結合サイト近辺のクロマチンの修飾によるON/OFF機構が働くSnail標的遺伝子の網羅的把握を実施する。