イメージング技術を用いた骨伸展時の骨細胞動態と骨リモデリング制御の解析

Research Project

Project/Area Number	22K10260
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 57070:Developmental dentistry-related
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	岡安麻里東京大学, 医学部附属病院, 病院診療医(出向) (10610941)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	大久保和美東京大学, 医学部附属病院, 講師 (10396715) 疋田温彦東京大学, 医学部附属病院, 特任教授 (60443397)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	骨リモデリング / イメージング / メカニカルストレス
Outline of Research at the Start	矯正歯科治療においては、矯正力により生じたメカニカルストレスにより、圧迫側では骨吸収が、牽引側では骨形成が亢進するが、その詳細は十分には明らかになっていない。本研究では、骨リモデリングをin vitroで再現可能な独自の系を培養細胞伸展システムと組み合わせ、メカニカルストレスが骨リモデリングに与える影響を細胞レベルで解析可能な系を構築し、基質変化や細胞動態を時空間的に明らかにする。本研究により得られた結果は、より良い矯正歯科治療の開発につながることが期待される。
Outline of Annual Research Achievements	まず、伸展刺激装置における骨代謝細胞ネットワーク再現系の構築のために、ストレックス社のストレッチチャンバーに、全身の細胞が緑色蛍光タンパク質を発現するEGFPマウス頭頂骨より採取した骨芽細胞を播種し、培養した。細胞がコンフルエントになった日をDay0 とし、βGlycerophosphateおよびAscorbic acidを含む骨芽細胞分化培地での培養を開始した。約4週後に石灰化結節の形成を肉眼的に、および顕微鏡下で確認した。その後、マクロファージおよび破骨細胞が赤色蛍光タンパク質を発現するRANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージを加え、活性型ビタミンD、プロスタグランジンE2を添加した培地にて共培養を開始した。以降、1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察した。伸展の頻度や伸展率について検討した結果、1週間に1回、伸展率は週2.5%, 5.0%が、チャンパーの破綻を生じない条件であることを確認した。また、伸展以外の力学的負荷を加える方法として、遠心刺激を与える試みを行った。50万細胞/6 cm dish相当でEGFPマウス由来骨芽細胞を播種し、分化培養を4週間行った後にRANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージとの共存培養を開始した。その後再びβGlycerophosphateおよびAscorbic acidを含む骨芽細胞分化培地に切り替え、遠心（1回30分，週3回　20 G, 200 G, 2000 G）を加えた。以降、1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の予定通り、伸展刺激装置における骨代謝細胞ネットワーク再現系の構築と、収縮刺激の最適化が実施できているため。
Strategy for Future Research Activity	伸展刺激によるRANKL およびSclerostin発現変化と細胞動態、基質変化の関連についての解析：前年度同様、ストレックス社のストレッチチャンバーで、EGFPマウス由来骨芽細胞を分化培養し、約4週後に石灰化結節の形成を確認後、RANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージとの共培養を行う。1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察する。前年度に設定した条件（週1回、伸展率2.5％あるいは5％）でチャンバーを伸展させ、複数の時点でRANKL あるいはSclerostin発現を、これらの分子のプロモーター活性により蛍光タンパクを発現する蛍光プローブ、免疫染色、あるいは遺伝子発現で確認する。また、伸展後の細胞動態について2光子顕微鏡による観察を行い、これらの分子の発現との関連について検討する。