Identification of TGF-beta signaling in secondary palate fusion
| Project/Area Number |
22K10280
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 57070:Developmental dentistry-related
|
|---|
| Research Institution | Nihon University |
|---|
Principal Investigator |
中嶋 昭 日本大学, 歯学部, 准教授 (50297842)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
|
|---|
| Keywords | 二次口蓋 / TGF-β / 口蓋裂 / 分子生物学 / 成長・発育 / TGF-beta |
|---|
| Outline of Research at the Start |
TGF-β1, β2および β3のそれぞれのRNAiをマウス二次口蓋組織にtransfectし，single およびdouble knockdownした際のligand発現やreceptorの発現，down streamであるSmad-dependent pathway (Smad 2/3/4) およびSmad independent pathway（TAK1/MLK3/MEKK1, p38, JNKおよびERK1/2）との関連性が，どのように二次口蓋癒合に影響を及ぼすかについて明らかにする。さらに，BMP，Wnt，FGFならびにEphrinとのCross talkについて影響について検討も加える。また，recombinant human (rh) TGF-β1, β2, β3刺激（Over expression）におけるautocrine反応についての観察を行い，TGF-βと口蓋裂との関連性の詳細について確認する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
Transforming Growth Factor beta (TGF-β) は，二次口蓋の正中癒合上皮（Medial Edge Epithelium: MEE）に強い遺伝子発現を示すことが明らかとなってきている。TGF-βは，TGF-β1, -β2, -β3の3つのisoformが存在し，TGF-β1のconditional knockout (TGF-β1-/-，TGF-β2-/-）mouseは，二次口蓋癒合期前に胎生期死亡することが報告されている。TGF-β3-/- mouseでは，MEEが上皮癒合せず口蓋裂となることが知られている。しかし，二次口蓋癒合時における，TGF-β1, β2, β3のそれぞれの機能をsingle knockdownおよびdouble knockdownした際のTGF-β signaling pathwayについては，十分に明らかとなっていない。
本研究目的は，二次口蓋のorgan cultureにより，TGF-βの機能をsiRNA処理でsingleおよびdouble knockdownを行い，ligand，receptor，downstream signalingおよびcross talk遺伝子の発現への影響について検討し，二次口蓋癒合時におけるTGF-β signaling pathwayの詳細について解明を行うことである。本研究の学術的独自性は，RNAiによりTGF-βをsingle knockdownおよびdouble knockdownすることによるligand同士の発現, receptor，downstreamであるSmad signaling pathwayや関連遺伝子への影響について明らかにし，症候群性および非症候群性口蓋裂の病因を解明することである。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
1．Small interfering RNA (siRNA) 処理下における二次口蓋成長発育の観察：胎生13日目のマウス口蓋突起のみ摘出し，フィルター上に試料をのせ，濃度200nMのsiRNAを含有したOPTI medium (Gibco) 溶液にてorgan cultureを行う。
2. MEE細胞の単離およびreal-time RT-PCRによるmRNA発現の定量解析：MEE細胞を単離を行った後、mRNA extraction kit（Quiagen）を使用し，MEE細胞のmRNAの抽出を行う。抽出したmRNAより1 st strand RT-PCR法でcDNA合成を行う。PCR primerを設計合成し，Quantitative real time RT-PCR法により上記遺伝子の増幅を行い，遺伝子発現を検討する。
3. Western blot法によるTGF-β遺伝子タンパク発現の定量解析：胎生13日目のマウス二次口蓋をsiRNA処理し，organ cultureしたsampleを，lysis bufferにてhomogenizeを行い，SDS-page Western blot 法にて，Target遺伝子タンパク発現量をコントロールと比較し確認を行う。また，濃度依存性であるかどうかについても検討を加える。
以上１～３に記載した「研究の目的」について、マウス胎児E13の二次口蓋についてsiRNAをtransfectionし、72時間まで培養を行い、Western blot法にてそれぞれのLigandの発現が抑制されているか確認し、siRNAの濃度依存的にタンパク発現は減少し、300-500nMの濃度のsiRNA transfection条件下で、Ligandを約80%の発現抑制することを確認できた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1）Western blot法によるタンパク発現の観察
試料をlysis bufferにてhomogenizeを行い，SDS-page法にて，sampleのloadingを行う。その後，membraneにtransferし，blocking処理を行った後，一次抗体および二次抗体を反応させ，Western blot detecting kit (Roche)にてタンパク発現量の定量比較を行う。
2)real-time RT-PCR法によるmRNA発現の観察
Down streamのmRNA発現については， 上記同様の試料からmRNA extraction kit（Quiagen）を使用し，mRNAの抽出し，RT-PCR法でcDNA合成を行った後，TGF-βに関わる転写因子のprimer合成し，quantitative real time RT-PCR法により発現を比較検討する。
3)統計処理による総合評価およびData信頼性の評価：Western blot法およびreal time RT-PCR法により，target遺伝子の発現とhousekeeping遺伝子GAPDHの発現とのrelative amountの結果を算出し，得られたdataについて統計処理ソフトウエアSPSSを使用し，ANOVA分散分析法を用いた後，Tukey’s HSD法にて，コントロール群，RNAi treatment群，rhTGF-β刺激群について有意差検定を行い，発現の相違について評価を行う。
さらに，上記実験を繰り返し行い，dataの再現性について総合評価を行った後，国際的な科学研究誌に論文投稿を行い本研究により得られた成果について発表を行う。
|
Report
(2 results)
Research Products
(2 results)
