| Project/Area Number |
22K10280
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57070:Developmental dentistry-related
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
中嶋 昭 日本大学, 歯学部, 准教授 (50297842)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | TGF-beta / 口蓋裂 / 二次口蓋 / 分子生物学 / 成長・発育 / TGF-β |
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| Outline of Research at the Start |
TGF-β1, β2および β3のそれぞれのRNAiをマウス二次口蓋組織にtransfectし，single およびdouble knockdownした際のligand発現やreceptorの発現，down streamであるSmad-dependent pathway (Smad 2/3/4) およびSmad independent pathway（TAK1/MLK3/MEKK1, p38, JNKおよびERK1/2）との関連性が，どのように二次口蓋癒合に影響を及ぼすかについて明らかにする。さらに，BMP，Wnt，FGFならびにEphrinとのCross talkについて影響について検討も加える。また，recombinant human (rh) TGF-β1, β2, β3刺激（Over expression）におけるautocrine反応についての観察を行い，TGF-βと口蓋裂との関連性の詳細について確認する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Transforming Growth Factor beta (TGF-β) は，二次口蓋の正中癒合上皮（Medial Edge Epithelium: MEE）に強い遺伝子発現を示すことが明らかとなってきている。TGF-βは，TGF-β1, -β2, -β3の3つのisoformが存在し，TGF-β1およびTGF-β2のconditional knockout (TGF-β1-/-，TGF-β2-/-）mouseは，二次口蓋癒合期前に胎生期死亡することが報告されている。TGF-β3-/- mouseでは，MEEが上皮癒合せず口蓋裂となることが知られている。しかし，二次口蓋癒合時における，TGF-β1, β2, β3のそれぞれの機能をsingle knockdownおよびdouble knockdownした際のTGF-β signaling pathwayについては，十分に明らかとなっていない。本研究目的は，二次口蓋のorgan cultureにより，TGF-βの機能をsiRNA処理でsingleおよびdouble knockdownを行い，ligand，receptor，downstream signalingおよびcross talk遺伝子の発現への影響について検討し，二次口蓋癒合時におけるTGF-β signaling pathwayの詳細について解明を行うことである。本研究の学術的独自性は，RNAiによりTGF-βをsingle knockdownおよびdouble knockdownすることによるligand同士の発現, receptor，downstreamであるSmad signaling pathwayや関連遺伝子への影響について明らかにし，症候群性および非症候群性口蓋裂の病因を解明することである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1．Small interfering RNA (siRNA) 処理下における二次口蓋成長発育の観察：胎生13日目のマウス口蓋突起のみ摘出し，フィルター上に試料をのせ，濃度200nMのsiRNAを含有したOPTI medium (Gibco) 溶液にてorgan cultureを行う。
2. MEE細胞の単離およびreal-time RT-PCRによるmRNA発現の定量解析：MEE細胞を単離を行った後、mRNA extraction kit（Quiagen）を使用し，MEE細胞のmRNAの抽出を行う。抽出したmRNAより1 st strand RT-PCR法でcDNA合成を行う。PCR primerを設計合成し，Quantitative real time RT-PCR法により上記遺伝子の増幅を行い，遺伝子発現を検討する。
3. Western blot法によるTGF-β遺伝子タンパク発現の定量解析：胎生13日目のマウス二次口蓋をsiRNA処理し，organ cultureしたsampleを，lysis bufferにてhomogenizeを行い，SDS-page Western blot 法にて，Target遺伝子タンパク発現量をコントロールと比較し確認を行う。また，濃度依存性であるかどうかについても検討を加える。
以上１～３に記載した「研究の目的」について、マウス胎児E13の二次口蓋についてsiRNAをtransfectionし、72時間まで培養を行い、Western blot法にてそれぞれのLigandの発現が抑制されているか確認し、siRNAの濃度依存的にタンパク発現は減少し、300-500nMの濃度のsiRNA transfection条件下で、Ligandを約80%の発現抑制することを確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度以降はdouble knock down siRNA処理した際の，二次口蓋成長発育のphenotypeおよび免疫染色にてdown stream遺伝子発現のdistributionの観察を繰り返し行う。定量解析においてはWestern blot (SDS-page)法にて，transcription factorおよびExtracellular matrix (ECM)タンパク発現を観察する。さらに，Quantitative real time RT-PCR法にて遺伝子発現の定量解析についても検討を行う。
1)Western blot法によるタンパク発現の観察
試料をlysis bufferにてhomogenizeを行い，SDS-page法にて，sampleのloadingを行う。その後，membraneにtransferし，blocking処理を行った後，一次抗体および二次抗体を反応させ，Western blot detecting kit (Roche)にてタンパク発現量の定量比較を行う。
2)real-time RT-PCR法によるmRNA発現の観察
Down streamのmRNA発現については， 上記同様の試料からmRNA extraction kit（Quiagen）を使用し，mRNAの抽出し，RT-PCR法でcDNA合成を行った後，TGF-βに関わる転写因子のprimer合成し，quantitative real time RT-PCR法により発現を比較検討する。
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